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渗透压反应增强子结合蛋白对高渗下人气道上皮细胞黏液分泌的影响

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中华医学杂志 2011年第8期91卷 549-553页

作者：涂静尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的探讨高渗刺激下渗透压反应增强子结合蛋白（OREBP）对热休克蛋白（HSP）70的转录调控及对黏液分泌的影响。方法采用体外培养的人气道上皮细胞HBE16为实验对象，分时程施加高渗条件，Western印迹检测OREBP和HSP70—2蛋白水平，ELISA... 详细信息

目的探讨高渗刺激下渗透压反应增强子结合蛋白（OREBP）对热休克蛋白（HSP）70的转录调控及对黏液分泌的影响。方法采用体外培养的人气道上皮细胞HBE16为实验对象，分时程施加高渗条件，Western印迹检测OREBP和HSP70—2蛋白水平，ELISA检测培养上清黏蛋白（MUC）5AC分泌；进一步构建系列截短和定点突变的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒，将其与OREBP的小片段干扰RNA（siRNA）共转染HBE16细胞，求证渗透压反应增强子（ORE）在HSP70-2基因启动子上游的结合位点及对MUC5AC分泌的影响。结果600mOsm／L高渗盐水培养HBE16细胞3h后，OREBP、HSP70-2和培养上清MUC5AC蛋白相对含量分别为（0．54±0．07，0．20±0．08，0．17±0．04），与对照组（0．21±0．05，0．15±0．06，0．13±0．04）相比显著增加到2．57、1．33和1．31倍（均P〈0．05），且随高渗培养时间延长而增加，6h时分别增加到2．81、3．07、3．77倍（均P〈0．01），9h时分别增加到3．57、5．13、4．00倍（均P〈0．01），12h时分别增加到4．24、5．33、4．54倍（均P〈0．01）；siRNA抑制OREBP表达48h后，高渗刺激下的OREBP、HSP704和上清MUC5AC蛋白相对含量为（0．36±0．08，0．33±0．08，0．24±0．05），和对照组（0．95±0．27，0．75±0．22，0．58±0．22）相比显著减少（蛋白抑制率分别为62％、56％和59％）（P〈0．05，P〈0．01，P〈0．05）；荧光素酶测定表明HSP70—2启动子上游-353至-66区域存在一个关键的ORE位点；定点突变失活-93区域的ORE位点可引起高渗诱导条件下HSP70-2启动子的活性显著降低（P〈0．01）。结论高渗盐水诱导OREBP通过与HSP704启动子上-93位ORE结合而激活HSP70—2转录并促进HBE16细胞MUC5AC高分泌。

关键词：渗透压载体蛋白质类 HSP70热休克蛋白类黏蛋白类

甘草酸对白细胞介素13诱导的大鼠气道黏液高分泌的作用

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中华医学杂志 2013年第28期93卷 2225-2229页

作者：童瑾周向东尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的探讨甘草酸对白细胞介素13（IL-13）诱导的气道黏液高分泌的作用。方法sD大鼠50只用随机数字表法随机分为5组：对照组、IL-13组和不同浓度（25、50、75mg／kg）甘草酸组。通过黏液组化染色，采用形态定量法计算气道上皮组织染色阳... 详细信息

目的探讨甘草酸对白细胞介素13（IL-13）诱导的气道黏液高分泌的作用。方法sD大鼠50只用随机数字表法随机分为5组：对照组、IL-13组和不同浓度（25、50、75mg／kg）甘草酸组。通过黏液组化染色，采用形态定量法计算气道上皮组织染色阳性部分表达强度积分；体外培养人支气管上皮细胞株HBE-16细胞，分为6组：阴性对照组（生理盐水）、IL-13对照组（10斗∥L的IL-13±生理盐水）和不同浓度甘草酸干预组（10μg/L的IL-13分别加25、50、75μmol／L甘草酸）、阳性对照组（10μg／L的IL-13±25μmol／L唑泊司他），通过反转录-PCR、Western印迹、荧光法和活性氧细胞渗透性指示剂（CM—H。DCFDA）探针的荧光强度分别检测各组HBE-16细胞黏蛋白（MUC）5ACmRNA、MUC5AC蛋白表达及细胞内的醛糖还原酶（AR）活性和活性氧（ROS）相对表达水平。结果体内实验：各组气道上皮组织染色阳性细胞表达强度积分分别为0．12±0．03、0．87±0．13、0．56±0．08、0．46±0．06、0．35±0．04，不同浓度甘草酸组明显低于IL-13组（均P〈0．05），并有剂量依赖性；IL-13组明显强于对照组（P〈0．05）。体外实验：各组HBEl6细胞的AR活性及48h时的ROS相对表达水平分别为0．156±0．021、0．692±0．039、0．436±0．019、0．323±0．042、0．290±0．027和5．127±0．033、24．257±3．263、11．966±0．283、8．892±0．521、6．426±0．173，IL-13对照组明显高于阴性对照组（P〈0．05），不同浓度甘草酸干预组明显低于IL．13对照组（均P〈0．05）；各组HBEl6细胞MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表达分别为0．82±0．05、3．22±0．12、2．57±0．34、2．09±0．54、1．58±0．22和0．18±0．04、0．65±0．15、0．48±0．11、0．33±0．19、0．26±0．06，IL-13对照组明显高于阴性对照组（P〈0．05），不同浓度甘草酸干预组明显低于IL-13对照组（均P〈0．05）。结论甘草酸可抑制IL-13诱导的MUC5ACmRNA和蛋白质的表达，抑制气道黏液高分泌。

关键词：甘草酸醛还原酶白细胞介素13 黏蛋白类

依赖Ca^(2+)的ATP过量释放在机械牵张所致气道上皮黏蛋白5AC高分泌中的作用

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华中科技大学学报（医学版） 2012年第1期41卷 32-35,40页

作者：苏晖晖尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究所俄罗斯布拉戈维申斯克675000

目的探讨人气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量的改变在机械通气所致气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞(HBE16)体外培养,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(... 详细信息

目的探讨人气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量的改变在机械通气所致气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞(HBE16)体外培养,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(压应力)给予压力牵张刺激,并利用向密闭盒中注入医用氧气增加压力以模拟机械通气,各组培养细胞依施加条件不同而分为对照组、单纯倾斜组、倾斜+钙离子螯合剂BAPTA-AM、倾斜+BAPTA-AM+钙离子螯合剂EGTA、加压+倾斜、加压+倾斜+嘌呤P2Y受体阻断剂reactive blue-2(RB-2)、加压+倾斜+BAPTA-AM、加压+倾斜+BAPTA-AM+EGTA,共8组,分别采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞活性、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平、ELISA法检测细胞培养上清液中MUC5AC含量、高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中ATP释放量。结果加压+倾斜组细胞MUC5AC mRNA相对含量、培养上清液中ATP释放量和MUC5AC蛋白分泌量分别为:(11.80±0.01)、(7.41±0.45)μmol/g、(0.77±0.26),显著高于单纯倾斜组的(6.60±0.01)、(2.76±0.47)μmol/g、(0.25±0.01)及对照组的(3.40±0.01)、(0.00±0.01)μmol/g、(0.02±0.01)(均P0.05);培养上清液中ATP释放量分别为:(0.05±0.02)μmol/g、(0.08±0.02)μmol/g,较加压+倾斜组显著降低(均P皮MUC5AC的分泌,其机制与气道上皮细胞依赖Ca2+的ATP的过量释放密切相关。

关键词：机械牵张气道上皮三磷酸腺苷钙离子黏蛋白

阿奇霉素通过基质金属蛋白酶9抑制气道黏液高分泌的实验研究．

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中华医学杂志 2011年第10期91卷 689-693页

作者：罗琳尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心

目的探讨阿奇霉素（AZT）通过基质金属蛋白酶9（MMP9）抑制气道黏液高分泌的作用机制。方法培养人支气管上皮细胞株HBE16细胞，以中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）为刺激物。AZT和表皮生长因子受体（EGFR）拮抗剂BIBX1522为干扰因素，分别对N... 详细信息

目的探讨阿奇霉素（AZT）通过基质金属蛋白酶9（MMP9）抑制气道黏液高分泌的作用机制。方法培养人支气管上皮细胞株HBE16细胞，以中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）为刺激物。AZT和表皮生长因子受体（EGFR）拮抗剂BIBX1522为干扰因素，分别对NE刺激的HBE16细胞进行预处理。培养细胞分为对照组、NE组、AZT＋NE组和BIBX1522＋NE组。用RT-PCR检测各组细胞黏蛋白（MUC）5ACmRNA和MMP9mRNA；ELISA检测培养上清液中MUC5AC蛋白含量；明胶酶谱法测定培养细胞内MMP9活性；Western印迹检测细胞中MMP9、前酶原MMP9（pro—MMP9）和金属蛋白酶类组织抑制剂（TIMP-1）蛋白含量及磷酸化的EGFR（p-EGFR）和磷酸化的信号末端调节激酶（P-ERK）。结果与对照组相比，NE组中MUCSAC与MMP9的基因转录（0．83±0．17，0．79±0．16）和蛋白表达水平（0．84±0．15，0．88±0．16）明显高（均P〈0．01），并且MMP9的活性指标高（392．33±18．33，P〈0．01），而pro—MMP9蛋白含量低（0．17±0．10，P〈0．01），TIMP-1含量未见明显改变，P—EGFR（0．86±0．23）和P—ERK（0．85±0．22）蛋白水平明显高（均P〈0．01）；与NE组相比，AZT＋NE组MUC5AC与MMP9的基因转录（0．36±0．15，0．41±0．09）和蛋白表达水平（0．30±0．08，0．37±0．14）明显低（均P〈0．01），MMP9活性也较低（295．33±14．54，P〈0．01），pro—MMP9（0．46±0．14）和TIMP-1（0．67±0．17）蛋白含量高（均P〈0．05），p-EGFR的蛋白水平未见明显改变，而p-ERK蛋白水平低（0．40±0．19，P〈0．01）；与NE组相比，BIBX1522＋NE组中除MIJC5ACmRNA（0．37±0．14）、MMP9mRNA（0．37±0．13）、p-EGFR（0．36±0．13）和p-ERK（0．37±0．18）明显低外（均P〈0．01），其余指标无明显改变，差异无统计学意义。结论AZT能抑制气道上皮HBE16细胞内MMP9的活性及其产生，由此发挥抑制气道黏液高分泌的作用。

关键词：黏蛋白类阿奇霉素基质金属蛋白酶9

JNK信号通路介导机械牵张引发的肺泡巨噬细胞炎性因子表达

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中国老年学杂志 2011年第16期31卷 3069-3071页

作者：童瑾尤列.皮尔曼维克多.科罗索夫重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的观察不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的影响,并探讨C-JUN氨基末端激酶(JNK)对机械牵张诱导的大鼠肺泡巨噬细胞IL-6和MIP-2表达的调控作用。方法采用支气管肺泡灌洗的方法取得大鼠肺... 详细信息

目的观察不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的影响,并探讨C-JUN氨基末端激酶(JNK)对机械牵张诱导的大鼠肺泡巨噬细胞IL-6和MIP-2表达的调控作用。方法采用支气管肺泡灌洗的方法取得大鼠肺泡巨噬细胞,并建立体外大鼠肺泡巨噬细胞梯度应力的机械牵张模型,应用RT-PCR和Western印迹方法观察IL-6和MIP-2的表达。进一步应用JNK特异性抑制剂SP600125,p38特异性抑制剂SB203580,及ERK特异性抑制剂PD98059给予同期干预,检测干预效果。结果随着机械牵张应力的增大,肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和其蛋白的表达递增(均P<0.05)。给予SP600125干预组大鼠肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和蛋白表达较机械牵张处理组明显降低。SB203580干预组及PD98059干预组的肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和蛋白水平较对照组明显升高,而与机械牵张处理组相比无明显变化。而IL-6 mRNA及其蛋白水平在上述各组中均无明显变化。结论大鼠巨噬细胞MIP-2的表达与机械牵张应力呈强度依赖性,JNK信号通路在周期性牵张诱导肺泡巨噬细胞表达释放MIP-2过程中起重要作用。

关键词： C-JUN氨基末端激酶机械牵张肺泡巨噬细胞巨噬细胞炎症蛋白-2 白介素-6

节律性压力波对家犬气道黏蛋白分泌平衡的影响及其机制

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中南大学学报（医学版） 2013年第7期38卷 670-675页

作者：刘诗兰尤列.皮尔曼维克多.科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的:观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法:24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2... 详细信息

目的:观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法:24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2);C组预先张力敏感性阳离子通道4(TRPV4)阻断剂钉红(RR)后按A组通气模式通气(C1,C2);D组预先TRPV4阻断剂RR处理后按B组通气模式通气(D1,D2)。通气12 h后,ELISA检测3组支气管灌洗液(BALF)中MUC(2,5AC和5B)蛋白含量;RT-PCR检测支气管肺组织匀浆中MUC(2,5AC和5B)mRNA转录水平。结果:与正常通气的A2组比较,过量通气的B2组家犬BALF中3种MUC蛋白含量显著升高,且以MUC5AC为主(P皮黏液层黏蛋白分泌平衡调控,其机制主要通过TRPV4通道实现。

关键词：节律性压力波张力敏感性阳离子通道黏蛋白

张力敏感性阳离子通道在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用

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中华医学杂志 2010年第33期90卷 2328-2333页

作者：钟甜尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 布拉戈维申斯克俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的观察张力敏感性阳离子通道、Ca^2＋内流和豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物（MARCKS）在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞（HBE16）体外培养，采用小型生物撞击机给予机械牵张刺激，各组培养细胞依施加条件不... 详细信息

目的观察张力敏感性阳离子通道、Ca^2＋内流和豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物（MARCKS）在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞（HBE16）体外培养，采用小型生物撞击机给予机械牵张刺激，各组培养细胞依施加条件不同而分为对照、牵张、牵张＋钆、牵张＋硝苯吡啶、牵张＋低分子量肝素、牵张＋MARCKS效应结构域（ED）锁核酸（LNA）以及牵张＋MARCKS的ED无关对照LNA序列共7组，分别采用逆转录聚合酶链反应（RT—Pert）和免疫荧光法观察与胞吐相关的突触相关膜蛋白SNAP23以及黏蛋白（MUC）5ACmRNA和蛋白表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞培养上清中MUC5AC分泌。结果机械牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞中SNAP23和MUC5AC表达，显著提升细胞培养上清中MUC5AC分泌（P〈0．05）；钆、硝苯吡啶、MARCKS的ED—LNA均能抑制机械牵张对SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌的提升作用（均P〈0．05）；而低分子量肝素未能显著降低SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌（P〉0．05）。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞MUC5AC的表达，其机制可能与张力敏感性阳离子通道、Ca^2＋内流和MARCKS途径有关。

关键词：机械牵张张力敏感性阳离子通道胞吐黏蛋白

神经调节蛋白1β在白细胞介素1β所致气道黏液高分泌中的作用

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中华医学杂志 2012年第28期92卷 1988-1991页

作者：周佳尤列.皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心

目的探讨神经调节蛋白1p（NRG-1p）在白细胞介素1β（IL-1β）诱导的气道黏液高分泌中的作用。方法用IL-1β刺激人气道上皮细胞株HBEl6细胞构建黏液高分泌模型，逆转录PCR法检测NRG-1βmRNA和黏蛋白（MUC）5ACmRNA，ELISA法检测NRG-1β... 详细信息

目的探讨神经调节蛋白1p（NRG-1p）在白细胞介素1β（IL-1β）诱导的气道黏液高分泌中的作用。方法用IL-1β刺激人气道上皮细胞株HBEl6细胞构建黏液高分泌模型，逆转录PCR法检测NRG-1βmRNA和黏蛋白（MUC）5ACmRNA，ELISA法检测NRG-1β和MUC5AC蛋白水平。用NRG-1β刺激后，ELISA法检测MUC5AC表达，Western印迹法检测磷酸化人表皮生长因子受体（ErbB）1～4。预先分别给予ErbBl—4抗体及p38触分裂原活化蛋白（MAPK）特异性抑制剂、细胞外信号调节蛋白（ERK）1／2特异性抑制剂、丝裂原压力活性蛋白激酶（MSK）1特异性抑制剂、环磷酸腺苷（c—AMP）反应原件结合蛋白（CREB）单克隆抗体，再经NRG-1β刺激后，ELISA法检测MUC5AC蛋白表达。结果IL-113显著增加NRG-1β、MUC5ACmRNA水平及其蛋白表达，且在蛋白水平呈现浓度正相关性。单独给予NRG-1β（1、10、100、200nmol／L）刺激HBEl6细胞，MUC5AC蛋白表达（0．3284-0．055、0．364±0．086、0．650±0．134、0．586±0．068）较对照组（0．227±0．019）显著增加，差异均有统计学意义（均P〈0．05），同时磷酸化ErbB2、3呈阳性表达，而磷酸化ErbBl、4呈近似阴性表达。预先给予ErbB2、3抗体、p38MAPK特异性抑制剂、ERKl／2特异性抑制剂和MSKl抑制剂、CREB抗体再给予NRG-1β母刺激者MUC5AC蛋白表达（0．221±0．033、0．238±0．044、0．386±0．021、0．352±0．022、0．294±0．017、0．252±0．019）较单独给予NRG-1β（0．650±0．134）显著降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论IL—β导致气道黏液高分泌可能通过NRG．1β／ErbB2、3异二聚体信号通路，并激活后续的MAPK／MsKl／cREB信号路径实现。

关键词：神经调节蛋白1 白细胞介素1β 黏蛋白类受体表皮生长因子

克拉霉素抑制气道黏液高分泌细胞内机制的研究

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中国抗生素杂志 2011年第8期36卷 630-634页

作者：罗琳尤列.皮尔曼维克多.科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心布拉戈维申斯克675000

目的研究克拉霉素(CLA)抑制气道黏液高分泌的细胞内分子机制。方法运用中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)刺激人类支气管上皮细胞株HBE16构建气道黏液高分泌模型,予以CLA和信号末端调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂U0126进行干预,采用RT-PCR检... 详细信息

目的研究克拉霉素(CLA)抑制气道黏液高分泌的细胞内分子机制。方法运用中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)刺激人类支气管上皮细胞株HBE16构建气道黏液高分泌模型,予以CLA和信号末端调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂U0126进行干预,采用RT-PCR检测细胞内黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,ELISA法检测细胞上清液中MUC5AC蛋白含量,Western blotting检测细胞内磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)、磷酸化P38(p-P38)的含量。结果克拉霉素和U0126均能降低气道黏液高分泌模型中MUC5AC基因转录和蛋白表达水平,并且使p-ERK表达水平下降,但对p-EGFR、p-JNK、p-P38的表达无明显作用。结论克拉霉素能抑制细胞内信号通路分子ERK1/2磷酸化水平,从而减少了气道上皮细胞产生MUC5AC,由此发挥抑制气道黏液高分泌的作用。

关键词：黏蛋白5AC 中性粒细胞弹性蛋白酶克拉霉素信号末端调节激酶