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猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化

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猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化

作者：季索菲安徽农业大学

学位级别：硕士

我国是世界养猪第一大国，拥有丰富的地方猪种遗传资源，但是由于对本地和引进优良种猪的特色性能的发掘、利用效率和保护等工作相对薄弱、繁育工作滞后，均直接导致了良种基因资源没有被充分利用，严重制约了我国养猪生产的水平和效益... 详细信息

我国是世界养猪第一大国，拥有丰富的地方猪种遗传资源，但是由于对本地和引进优良种猪的特色性能的发掘、利用效率和保护等工作相对薄弱、繁育工作滞后，均直接导致了良种基因资源没有被充分利用，严重制约了我国养猪生产的水平和效益，与世界养猪第一大国的位置很不相称。因此，以我国地方猪种遗传资源为基础，借助体细胞克隆、转基因、胚胎移植等现代生物技术，丰富资源保护、新品种培育手段，提高本地猪种利用率，实现本土化供种，减少引种数量，打破长期依赖从国外引种的怪圈，是我国养猪业可持续发展亟待攻克的重要课题之一。此外，开展猪体细胞克隆及转基因克隆研究不仅对畜牧业具有重大推动作用，也将为人类医学和生物学研究提供理想的动物模型。但是，转基因克隆猪的生产程序复杂、成本高、效率低下等不足制约着这一技术直接造福于人类。故此，为了利用细胞培养技术丰富地方猪种遗传资源保护手段，以及为转基因克隆猪生产提供丰富的体细胞素材，为创制猪转基因育种新材料奠定基础，本研究开展了以下实验：实验一以出生后30日龄的安庆六白猪耳部皮肤组织和处于妊娠期第40天左右的梅山猪胎儿组织为材料，采取组织块接种培养法或胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞，并对所获得的细胞系的体外培养生物学特性进行了检测，包括细胞形态学观察和生长曲线绘制。结果表明：所获安庆六白猪和梅山猪的细胞系符合成纤维细胞的基本特征：细胞贴壁生长状态呈典型的梭型、星型或多边形，细胞之间连接紧密，成片生长，生长曲线呈典型的“S”状。通过组织块接种培养法或胰蛋白酶消化法，本试验共成功建立了4头雄性安庆六白猪和15头梅山猪胎儿的19个成纤维细胞系，为后续研究提供的丰富的材料。实验二以实验一建立的梅山猪胎儿成纤维细胞系(pigfetal fibroblasts cells,PFCs)为材料，探讨以脂质体介导pEGFP-N1转染梅山猪胎儿成纤维细胞的最佳条件，具体研究了脂质体(Lipofectamin)2000)和质粒(pEGFP-N1)DNA的比例、细胞密度、转染试剂盒处理细胞时间、血清添加与否等。发现在6孔板体系下，用Lipofectamine2000转染梅山猪成纤维细胞系当细胞密度为80-90%时，质粒pEGFP-N1为4μg，Lipofectamine2000加样量为8μl，转染过程中不含双抗和血清，在转染5小时后换上新鲜的不含抗生素的培养基，在此条件下，梅山猪转pEGFP-N1的效果最佳，转染效率约为30%-40%。实验三首先比较了梅山猪胎儿不同个体PFCs脂质体转染pEGFP-N1的效率。用实验二优化的转染方案对不同梅山猪转基因情况进行了研究，发现No.6和No.13猪的PFCs转染效率较高;其次，为探索建立两基因共转PFCs的方案，我们用Lipofectamine)2000将pEGFP-N1和DsRed两个商业化载体共同转染PFCs，发现当两个载体各为3μg时，转染效果最佳，而且所获PFCs表达绿色荧光时并不都表达红色荧光，但表达红色荧光的PFCs却都表达绿色荧光。实验四摸索了梅山猪PFCs电穿孔转染条件。采用BTX电转仪和InvitrogenNeon电转仪对梅山猪PFCs进行电转pEGFP-N1。以电击2d后的细胞存活率、发绿光比例为综合判定参数优劣。发现使用BTX电转仪的最佳参数为：场强170V/cm、脉冲时间15ms、脉冲1次;InvitrogenNeon的最优参数为：场强1400V/cm、脉冲时间30ms、脉冲1次。实验五以脂质体介导转染所获表达pEGFP-N1的梅山猪PFCs为供核生产克隆胚，并1-2细胞期的克隆胚移植给代孕母猪体内，200枚/头，共移植19头受体，其中1头受体怀孕期满产下4头克隆猪，经PCR检测有3头克隆仔猪携带EGFP基因。总之，本研究集成了组织块法、胰蛋白酶消化法及玻璃化冷冻技术，在猪上首次通过组织块胰蛋白酶消化、冷冻再复苏接种法建立了梅山猪PFCs;筛选出适于梅山猪PFCs的脂质体介导转基因方案，并成功获得转基因克隆猪;通过脂质体介导两基因共转梅山猪PFCs，获得阳性细胞系，为下一步制备多基因共转克隆猪奠定了基础;实验还表明不同品牌的电转仪介导梅山猪PFCs时最优参数不同，提示利用电转法制备转基因PFCs之前要对特定品牌电转仪的电转参数进行优化筛选。

关键词：梅山猪成纤维细胞细胞培养转染绿色荧光蛋白脂质体法电穿孔法

工厂化养殖稚幼中华鳖的环保型温室构建与性能试验

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农业工程学报 2017年第17期33卷 167-172页

作者：蒋业林张静侯冠军程云生李翔季索菲张太祥安徽省农业科学院水产研究所合肥230031 安徽省鳖类养殖工程技术研究中心蚌埠233040 安徽省喜佳农业发展有限公司蚌埠233040 六安市帮群水产养殖有限公司六安237001

为了满足稚幼中华鳖工厂化养殖的需求,响应减少CO_2排放的政策,设计建造了符合其生活习性的环保型温室。该温室使用地源热泵空调系统控温,底部排污系统排出残饵和排泄物,养殖池内配置网片隐蔽巢供稚幼鳖栖息,采用微孔增氧装置和微生物... 详细信息

为了满足稚幼中华鳖工厂化养殖的需求,响应减少CO_2排放的政策,设计建造了符合其生活习性的环保型温室。该温室使用地源热泵空调系统控温,底部排污系统排出残饵和排泄物,养殖池内配置网片隐蔽巢供稚幼鳖栖息,采用微孔增氧装置和微生物制剂调控水体中溶解氧、氨氮和亚硝态氮含量。结果表明通过使用地源热泵空调,1栋占地780 m2的温室在10个月的生产期内减少使用燃煤约35 t,减少CO_2排放约84.01 t。养殖水体中溶解氧质量浓度5.83~7.68 mg/L,氨氮和亚硝态氮质量浓度分别在0.39~0.83 mg/L和0.14~0.16 mg/L范围内。经过约10个月的养殖(放养质量约为3.5 g,密度为50只/m2),平均质量为581 g,存活率86.2%,饲料转化率1.18,特定生长率1.77,1栋温室年利润为157 870元。综上,该工厂化养殖稚幼鳖的环保型温室能为其提供舒适的生活环境,表现出良好的经济效益和社会效益,有很大的推广价值和实际意义。

关键词：环保温室试验稚幼鳖经济效益社会效益

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池塘鱼-鳖-草-螺生态种养新技术

重庆水产 2023年第3期 55-56页

作者：邵为旭季索菲怀远县荆山镇经济发展中心安徽怀远233400 安徽省农业科学院水产研究所安徽合肥230031

鱼-鳖-草-螺养殖能充分利用鱼塘水体资源,改善水中的溶氧条件,有利于鱼的代谢和浮游生物的繁殖;能加速淤泥中有机物的氧化分解,防止水质突变;有利于净化和稳定水质,促进鱼的生长。鱼不仅可以直接摄食鳖的残饵,而且有机物的分解为浮游生... 详细信息

鱼-鳖-草-螺养殖能充分利用鱼塘水体资源,改善水中的溶氧条件,有利于鱼的代谢和浮游生物的繁殖;能加速淤泥中有机物的氧化分解,防止水质突变;有利于净化和稳定水质,促进鱼的生长。鱼不仅可以直接摄食鳖的残饵,而且有机物的分解为浮游生物的生长、繁殖提供了良好的物质条件,浮游生物大量繁殖又为滤食性鱼提供了大量的饵料,提高了饵料的利用率。

关键词：池塘鱼氧化分解浮游生物水质突变滤食性物质条件鳖

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池塘鱼-鳖-草-螺生态种养新技术

科学养鱼 2023年第7期 30-31页

作者：邵为旭季索菲怀远县荆山镇经济发展中心安徽怀远233400 安徽省农业科学院水产研究所安徽合肥230031

关键词：池塘鱼氧化分解生态养殖模式生态平衡浮游生物滤食性水质突变

电化学降解技术在水产养殖废水处理的研究现状及应用前景

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水处理技术 2018年第7期44卷 6-9,25页

作者：王芬程云生侯冠军季索菲张晔蒋业林安徽省农业科学院水产研究所安徽合肥230031 安徽省鳖类养殖工程技术研究中心安徽蚌埠233701 马鞍山春盛生态农业有限公司安徽马鞍山243000

随着水产养殖量逐年增加,养殖废水的污染问题日趋严重,尤其是氨氮、亚硝态氮和有机物等对周围环境造成了巨大的危害。主要论述了电化学降解技术处理废水中氨氮、亚硝态氮和有机物的研究现状和应用前景,重点介绍降解机理及影响因素。

关键词：水产养殖废水电化学降解研究现状应用前景

黄河故道安徽段浮游植物群落结构特征及其与环境因子关系

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生态学杂志 2022年第7期41卷 1297-1306页

作者：赵秀侠卢文轩季索菲方婷杨坤高娜侯冠军安徽省农业科学院水产研究所合肥230001 水产增养殖安徽省重点实验室合肥230001

为明晰黄河故道水域生态完整性与生物多样性状况,于2018年对黄河故道安徽段浮游植物群落结构进行了调查。结果表明:共鉴定浮游植物7门46属94种,绿藻门种类最多,为20属51种,占总种类数的54.26%;其次为硅藻门,为11属17种,占总种数的18.09%... 详细信息

为明晰黄河故道水域生态完整性与生物多样性状况,于2018年对黄河故道安徽段浮游植物群落结构进行了调查。结果表明:共鉴定浮游植物7门46属94种,绿藻门种类最多,为20属51种,占总种类数的54.26%;其次为硅藻门,为11属17种,占总种数的18.09%;黄河故道浮游植物丰度为0.507×10^(5)~8.406×10^(5) cell·L^(-1),平均为2.875×10^(5) cell·L^(-1),浮游植物生物量为0.039~0.926 mg·L^(-1),平均为0.254 mg·L^(-1);蓝藻门与绿藻门是浮游植物丰度主体,绿藻门与甲藻门是生物量组成的主体;运用浮游植物多样性与均匀度指数评价黄河故道水质现状为β中污-轻污染水平;单因素相似性分析和非度量多维尺度分析发现,不同季节样点间浮游植物群落结构差异达显著水平(r=0.625,P季节分化明显;浮游植物群落结构与水环境因子的冗余分析结果显示,不同季节影响浮游植物群落组成及分布的环境因子不同,铵态氮、水温、水深、溶解氧是影响浮游植物群落组成的主要环境因素。研究结果可为黄河故道水资源保护与生态修复提供依据。

关键词：黄湖故道安徽段浮游植物环境因子冗余分析

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提取方法对叶绿素含量的影响

廊坊师范学院学报（自然科学版） 2022年第4期22卷 56-59页

作者：徐伟季索菲安徽林业职业技术学院安徽合肥230031 安徽省农业科学研究院安徽合肥230061

以绿萝叶片为试验材料,采用80%丙酮研磨法、96%乙醇和DMSO浸提法提取叶绿素,用紫外分光光度法对叶绿素含量进行测定,研究提取方法对叶绿素提取量的影响。结果发现:三种方法得到的叶绿素提取液的紫外光谱相似,在665-667nm有最大吸收峰值... 详细信息

以绿萝叶片为试验材料,采用80%丙酮研磨法、96%乙醇和DMSO浸提法提取叶绿素,用紫外分光光度法对叶绿素含量进行测定,研究提取方法对叶绿素提取量的影响。结果发现:三种方法得到的叶绿素提取液的紫外光谱相似,在665-667nm有最大吸收峰值,但是吸收强度不同。80%丙酮研磨法所得叶绿素含量最低,96%乙醇和DMSO浸提法所得叶绿素含量较高,但差异不显著。表明96%乙醇和DMSO是良好的叶绿素提取溶剂,但用96%乙醇浸提法所得叶绿素提取液稳定性稍差,要注意避光保存。比较不同方法的测定结果,分析其优缺点,为今后研究选择合适的叶绿素提取方法提供依据。

关键词：叶绿素分光光度法吸收峰二甲基亚砜丙酮

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鳜鱼生物学特性及养殖技术

农技服务 2016年第4期33卷 199-200页

作者：陶良保季索菲安徽省青阳县渔业渔政局安徽青阳242800 安徽省农科院水产研究所安徽合肥230031

本文介绍了鳜鱼生物学特性及人工繁殖、苗种培育、池塘养殖等技术。

关键词：鳜鱼生物学特性苗种培育池塘养殖技术

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绿萝组培外植体消毒灭菌技术研究

廊坊师范学院学报（自然科学版） 2016年第4期16卷 54-56页

作者：徐伟季索菲安徽林业职业技术学院安徽合肥230031 安徽省农业科学院安徽合肥230031

为研究不同灭菌时间对绿萝外植体的影响,试验先采用75%酒精灭菌30s,后用有效氯2%的次氯酸钠溶液对绿萝叶片、叶柄、茎段都进行6min、8min、10min的灭菌处理。试验结果显示,先采用75%酒精灭菌30s,后用有效氯浓度2%的次氯酸钠对绿萝叶片... 详细信息

为研究不同灭菌时间对绿萝外植体的影响,试验先采用75%酒精灭菌30s,后用有效氯2%的次氯酸钠溶液对绿萝叶片、叶柄、茎段都进行6min、8min、10min的灭菌处理。试验结果显示,先采用75%酒精灭菌30s,后用有效氯浓度2%的次氯酸钠对绿萝叶片、叶柄和茎段外植体灭菌最佳时间分别为6min、10min和8min。

关键词：绿萝灭菌组织培养