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大肠杆菌LTKA63及LTB和霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达和鉴定

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大肠杆菌LTKA63及LTB和霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达和鉴定

作者：夏肖萍浙江大学

学位级别：硕士

基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原，其免疫效果常不尽人意，通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果。霍乱肠毒素B亚单位(CTB)一直是效果较为公认的粘膜免疫佐剂，但近年文献报道重组CTB与抗原混合后诱导S-IgA产生的能力弱或... 详细信息

基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原，其免疫效果常不尽人意，通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果。霍乱肠毒素B亚单位(CTB)一直是效果较为公认的粘膜免疫佐剂，但近年文献报道重组CTB与抗原混合后诱导S-IgA产生的能力弱或无，但诱导血清IgG作用较强。CTB的佐剂活性主要依赖其与细胞表面神经节苷酯(GM)结合的活性。由于CTB主要通过激活Th2途径发挥其佐剂活性，但Th2途径可产生IL-4，IL-4能选择性地促进IgE合成，因而认为CTB可引起变态反应。大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是近年报道较多的粘膜免疫佐剂，因其肠毒性而在实际应用中受到限制。LT分子结构与CT类似，一个A亚单位和五个相同的B亚单位组成。A亚单位具有ADP-核糖转移酶活性，是毒素的毒性部位。B亚单位能与哺乳动物细胞表面神经节苷脂GM结合，介导A亚单位进入靶细胞。不少研究结果证实，将LT第63位丝氨酸突变为赖氨酸的突变体(LTK63)的毒性几乎完全消失，但其免疫佐剂活性不变。很多文献报道，单一使用LTKA63或LTB也具有粘膜免疫佐剂活性。LTB的佐剂作用也依赖其与细胞表面神经节苷酯(GM)结合的活性，LTKA63的作用机制尚不清楚，但大部分研究者认为与其ADP-核糖转移酶活性无关。LT主要激活Th1途径，其次是Th2途径，故认为LT一般不引起浙江大学硕士学位论文中艾方要变态反应。令人感兴趣的是，LTKA63和LTB佐剂活性的作用机制不同，两者合用可能有协同效应。综上所述，LTK63、LTKA63或LTB较之CTB更适合作为D服基因工程疫苗的佐剂。实验方法 1．菌株来源及培养大肠杆菌4485株(ECOli 44815)购自中国药品生物制品检定所。将大肠杆菌44815 株接种于LB琼脂平板上，37oC培养24 h。挑取单个菌落进行革兰染色镜检，若是革兰阴性、中等大小杆菌者，再次转种培养。加热灭活的霍乱弧菌乐74株培养物由浙江省医学科学院何浙生研究员提供。 2．细菌基因组DNA的制备采用常规的苯酚一氯仿法提取大肠秆菌 4481株与霍乱弧菌东 74株培养物的基因组 DNA，经无DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE缓冲液中作为PCR的模板，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。 *** 根据报道的 LTA、LTB和 CTB基因序列设计引物，采用 PCR扩增 LTA、LTB和 CTB 基因，浚乙锭预染色的1．5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 LTA 基因扩增的引物序列：上游了CCG GAT ATC ATG AAA AAT ATA ACT TTC－3’(ECORV)，厂游 5’－CCG CMM TAT TCA TAA TTC ATC CCG－3’(Xhol)。反应体积 100 ql，内含 25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI，、3．0 U EX Taq酶、100 ng DNA 模板和IXP＊R缓冲液(pH8．8)。P＊R反应参数为：94℃sffi川XI cy。ie;94℃305，50℃ 305，72℃60 S，x10。wies：94℃祁S，5丁C30S，72℃70 S(以后每循环增加105)，X20＊吓1＊S： 720C10min，XI cycle。预期的LTA基因目的扩增片段人小为777hp。 LTB＄1lXllEJ791：x胁上游 5’－CCG pG AAT AAA GTA AAA TA－3’(ECOIU)，卜游5’－CCG CTMGAG CTA GT T TTC CAT ACT GA－3’(Xhol)。反应体积100 HI，内含 25 pmol引物、2．5 mol／L dNTP、20 mol／L MgCI。、30 U EX Taq酶、100 ng DNA模板和 1 XPCR缓冲液(pH88)。PCR反应参数为：94’C5min，XI Cycle;94”C30S，50’C305，72 ～2～一 ’C45S，X10cycles;94’C305，50’C305，72’C505(以后每浙增加SS)，X20cycles;72 C10min，XI cycle。预期的 Lh基因目的扩增片段人小为 375 hP。 CTBgnch上游了－CCGAfATGATTAAATTAAAAThTG－3’(ECOR！)，下游5’－CCG pATATC T TATA ATATT

关键词：大肠杆菌不热肠毒素 A亚单位/B亚单位霍乱弧菌肠毒素 B亚单位基因克隆表达载体/构建重组蛋白/表达 SDS-PAGE 琼脂免疫扩散试验 ELISA

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甲壳素纤维织品体外抗细菌和癣菌活性的研究

中国现代应用药学 2003年第1期20卷 16-19页

作者：钟晓芝夏肖萍严杰温州医学院绣山校区病原生物学和免疫学教研室浙江温州325003 浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031

目的　观察甲壳素含量不同的针织布体外抑制或杀灭细菌或癣菌的作用。方法　采用不同细菌或癣菌接种量 (1× 10 6～ 1× 10 2 /mL) ,用体外抑菌试验和杀菌试验检测 10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金... 详细信息

目的　观察甲壳素含量不同的针织布体外抑制或杀灭细菌或癣菌的作用。方法　采用不同细菌或癣菌接种量 (1× 10 6～ 1× 10 2 /mL) ,用体外抑菌试验和杀菌试验检测 10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抗菌作用 ,实验中以普通全棉布作为对照。结果　作为对照的普通全棉布对上述细菌或癣菌无任何抑制作用。与普通全棉布比较 ,10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抑制率 [抑制率 =(每毫升CFU值每毫升接种量 ) /每毫升CFU值× % ]分别高于普通全棉布的 99.8%～ 99.9%、85 .2 %～ 89.6%和 74.2 %～ 85 .8% ,表明随甲壳素纤维含量逐渐增高 ,抑菌作用逐渐增强 (χ2 ≥ 18.2 5 ,P <0 .0 1)。所有甲壳素纤维织品均未发现有体外杀菌活性。结论　受试的甲壳素纤维织品无体外杀菌活性 ,但均有一定的体外抑制细菌或癣菌作用 ,以 10 0 %甲壳素纤维无纺布抑制作用最强 ,2 0 %甲壳素针织布次之 ,10 %甲壳素针织布较弱。

关键词：甲壳素纤维抑菌试验杀菌试验

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第9期29卷 801-806页

作者：汪浙炯夏肖萍楼宏强孙爱华严杰浙江大学医学院病原生物学系杭州310058 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科金华职业技术学院医学院浙江医学高等专科学校

目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐药性关系。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段，T—A克隆后测序。构建phoQ和phoP基因原核表达系统，Ni-NT... 详细信息

目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐药性关系。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段，T—A克隆后测序。构建phoQ和phoP基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rPhoQ和rPhoP，皮内注射免疫法制备兔抗血清，免疫双扩散法测定抗血清效价。采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因，采用PCR、测序和Westernblot对phoQ。突变株进行鉴定。采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗，丰素的最低抑菌浓度（MIC）。结果与GenBank中相关序列比较，所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98．7％一99．6％和98．7～100％、98．4％～99．8％和99．1％～100％。采用pET-42a和***121DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP。rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1：4和1：8抗血清。经PCR、测序和Westernblot鉴定，两株phoQ^-突变株phoQ基因及产物均缺失。上述phoQ^-突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1／512～1／2048。结论PhoQ／PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统，该系统介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。

关键词：铜绿假单胞菌 phoQ/phoP基因基因敲除氨基糖苷类抗生素

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

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中国人兽共患病学报 2006年第2期22卷 107-110页

作者：全胜夏肖萍胡伟航浙江大学邵逸夫临床医学研究所胃肠疾病实验室在读研究生浙江大学附属邵逸夫医院检验科杭州310016 杭州市第一人民医院急诊科杭州310006

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA... 详细信息

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。

关键词：大肠杆菌 LTKA63基因克隆/表达载体构建,重组蛋白/表达,粘膜免疫/佐剂活性 Th1/Th2

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百日咳鲍特菌外膜蛋白的致病性与免疫原性

国外医学（微生物学分册） 2002年第4期25卷 21-22,48页

作者：夏肖萍浙江大学医学院微生物学教研室

百日咳鲍特菌外膜蛋白是存在于细菌表面的一组功能性蛋白质,包括P69、FhaC和BrkA,其中以P69最为重要。P69分子中的RGD-(GGxxP)_5和(PQP)_5两个富含脯氨酸结构区分别具有粘附作用和很强的免疫原性,其抗体具有较强的保护作用,可作为无细... 详细信息

百日咳鲍特菌外膜蛋白是存在于细菌表面的一组功能性蛋白质,包括P69、FhaC和BrkA,其中以P69最为重要。P69分子中的RGD-(GGxxP)_5和(PQP)_5两个富含脯氨酸结构区分别具有粘附作用和很强的免疫原性,其抗体具有较强的保护作用,可作为无细胞型百日咳疫苗中的一个重要抗原成分。P69具有多态性,百日咳流行菌株的P69已从P69A转变成以P69B或P69C为主,所引起的抗原性漂移与疫苗预防效果下降有直接关系。FhaC是该菌的一种外膜蛋白,能特异地辅助丝状血凝素分泌;BrkA不仅具有蛋白转运功能,且能抵抗抗体依赖补体介导的细胞毒作用。

关键词：百日咳鲍特菌外膜蛋白致病性免疫原性

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

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浙江大学学报（医学版） 2009年第3期38卷 276-282页

作者：樊欢孙爱华夏肖萍孙琦严杰浙江大学医学院病原生物学系浙江杭州310058 浙江医学高等专科学校浙江杭州310053 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科浙江杭州310016

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS... 详细信息

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌*** BL21DE3pET42a-comD、***21DE3pET42a-comE和*** BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。

关键词：链球菌,肺炎/遗传学聚合酶链反应信号传导 β内酰胺酶类抗药性,细菌基因表达重组蛋白质类基因表达调控,细菌

雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制研究

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雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制研究

雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制研究

中华医学会第七次全国检验医学学术会议

作者：夏肖萍严杰浙江大学附属邵逸夫医院检验科浙江大学紫金港校区医学院基础医学部

目的探讨雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用台盼蓝染色法、透射电镜和流式细胞术,分别检测不同浓度和作用时间下,雷公藤红素诱导HL-60细胞凋亡以及对细胞Fas、FasL和NF-kBP65表达的影响。结果:0.5-... 详细信息

目的探讨雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用台盼蓝染色法、透射电镜和流式细胞术,分别检测不同浓度和作用时间下,雷公藤红素诱导HL-60细胞凋亡以及对细胞Fas、FasL和NF-kBP65表达的影响。结果:0.5-2.5μmol/L浓度雷公藤红素作用24 h,HL-60细胞凋亡率均明显高于不加药物的对照组(P<0.05)。当雷公藤红素浓度为1.5μmol/L时,细胞凋亡率最高并呈时间依赖效应。雷公藤红素作用的HL-60细胞,可呈现典型的细胞凋亡形态学改变。1.5μmol/L雷公藤红素可明显提高Fas和FasL阳性HL-60细胞百分率(P<0.05),但抑制细胞NF-kBP65的表达(P<0.05)。结论:雷公藤红素可有效地诱导HL-60细胞凋亡,其机制与雷公藤红素可上调Fas、FasL基因及下调NF-kB基因表达有关。

关键词：雷公藤红素 HL-60细胞凋亡机制

来源： cnki会议评论

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雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制研究

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议

作者：夏肖萍全胜浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科浙江大学城市学院医学系

目的探讨雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用及其机制。方法在24孔细胞培养板中每孔接种1×10/ml的HL-60细胞,37℃、5%CO条件下预培养24 h。试验组加入终浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0μmol/L的雷公藤红素,实验中同时...

目的探讨雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用及其机制。方法在24孔细胞培养板中每孔接种1×10/ml的HL-60细胞,37℃、5%CO条件下预培养24 h。试验组加入终浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0μmol/L的雷公藤红素,实验中同时设置不加药物的对照组。另将HL-60细胞与终浓度为1.5μmol/L雷公藤红素分别培养0、4、8、12、16、24 h。所收集的细胞用PBS洗涤2次后重悬,调整细胞浓度为1×10/ml。然后分别采用台盼蓝

关键词：

来源： cnki会议评论

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浙江大学学报（医学版） 2003年第1期32卷 17-20页

作者：夏肖萍严杰钊守凤毛亚飞李淑萍浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 ***4 4 815株与 ***东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 ... 详细信息

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 ***4 4 815株与 ***东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 *** BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。

关键词：大肠杆菌 LTB基因霍乱弧菌 CTB基因分子克隆 LTB融合蛋白 CTB融合蛋白免疫学