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Tat融合蛋白制备和初步长期毒性研究

Tat融合蛋白制备和初步长期毒性研究

作者：夏振娜第二军医大学

学位级别：硕士

目的:制备HIV-1 TatE-pET32a融合蛋白,研究Tat融合蛋白（Tat Fusion Protein, Tat-FP）与弗氏佐剂乳化对SD大鼠的免疫原性和毒性反应,明确Tat-FP的毒性反应的严重程度和可逆性,对Tat-FP作为HIV-1疫苗的安全性做出初步评价。方法:（1）Ta... 详细信息

目的:制备HIV-1 TatE-pET32a融合蛋白,研究Tat融合蛋白（Tat Fusion Protein, Tat-FP）与弗氏佐剂乳化对SD大鼠的免疫原性和毒性反应,明确Tat-FP的毒性反应的严重程度和可逆性,对Tat-FP作为HIV-1疫苗的安全性做出初步评价。方法:（1）Tat-FP制备:使用已构建好的含pET32a-TatE （1-101aa）质粒的大肠杆菌*** BL21 （DE3）菌株,大量培养,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-Thiogalacto- side,IPTG）诱导目的蛋白的表达;离心收集菌体,用lysis buffer缓冲液重悬后超声裂解菌体,低温高速离心,收集上清,目的蛋白即存在于上清中;滤纸过滤后,用Ni-NTA纯化柱（镍柱）对滤液进行纯化,收集目的蛋白,即Tat-FP;经SDS-PAGE电泳验证和复性后,以Bradford法检测蛋白浓度,间接ELISA法检测Tat-FP的免疫原性。（2）Tat-FP的初步长期毒性研究:Sprague-Dawley（SD）大鼠70只,随机分为7个组:Tat-FP iv组（200μg/只）、Tat-FP sc组（200μg/只）、Tat-FP（20μg/只）+弗氏佐剂皮下注射低剂量组、Tat-FP（200μg/只）+弗氏佐剂皮下注射高剂量组、弗氏佐剂对照组、溶媒+弗氏佐剂对照组、生理盐水对照组。每周给药一次,共给药8次,除第一组为静脉注射给药外,其余六个组均为皮下注射给药,用到佐剂时均需与蛋白等体积乳化后给药,各组给药体积均为0.4ml /只。每周称体重一次,给药结束一周后（W9）每组麻醉处死6只动物,恢复3周后（W12）每组麻醉处死剩余4只动物。动物麻醉后均腹主动脉采血进行血液生化、血液学、免疫原性和免疫毒性等指标测定,同时对重要脏器进行病理组织学观察。第3、5、7、9、12周采血检测抗体。测定的血液学指标有红细胞（RBC）计数、血红蛋白（HGB）定量、红细胞压积（Hct）、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白容量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLAT）、白细胞（WBC）计数、中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞（LYMPH）、单核细胞（MONO）、嗜酸性粒细胞（EOS）、嗜碱性粒细胞（BASO）、大未染色细胞（LUC）、网织红细胞计数（RETIC）、凝血酶原时间（PT）;血液生化指标有血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（Glu）、总胆固醇（TCH）、甘油三脂（TG）、肌酸磷酸激酶（CPK）,血清钙（Ca）、磷（P）、钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）。（3）流式细胞术检测Tat-FP对外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞分型的影响。（4）间接ELISA法检测血清抗体水平;ELISA法检测血清IgG、IgM、IgA和C3的水平。（5）考察Tat-FP对IL-4, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-10和TNF-α等细胞因子水平的影响。结果:（1）除Tat-FP iv组和生理盐水对照组以外,其余组的动物给药后各组均有部分动物出现不同程度的抓挠给药部位;各个皮下注射组（生理盐水对照组除外）动物的给药部位均出现不同程度肿胀、皮肤溃烂和结痂,解剖发现肿块里面充满了脓性物质,可能是由于佐剂与药物乳化后,延缓了药物的吸收,导致局部炎性反应。（2）与溶媒+弗氏佐剂对照组和/或生理盐水对照组相比,Tat-FP+弗氏佐剂高剂量可使停药期大鼠NEUT比例明显升高,LYMPH比例明显降低,WBC虽没统计差异但也有升高趋势。可能与此剂量引起的局部炎症较严重有关。Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组可使恢复期大鼠NEUT比例明显升高,LYMPH比例明显降低。可能与此剂量引起的局部炎症尚没有完全恢复有关。（3）无论是停药期还是恢复期,与佐剂对照组和/或溶媒+弗氏佐剂对照组和/或生理盐水对照组相比,Tat-FP各给药组的部分血液生化指标虽然有显著差异,但指标数值均在正常范围内波动,而且无明显量效关系,与药物作用无关。（4）骨髓涂片检查提示骨髓组织出现了炎性相关的反应。（5）病理组织学检查各组主要脏器绝对重量和相对重量的改变无明显量效关系,各组动物均未观察到与药物作用相关的实质脏器（如肝脏等）病理改变,未发现任何免疫毒性相关的组织学病变,但含佐剂成分给药后,大鼠均出现了局部炎症。（6）与生理盐水对照组相比,恢复期时,Tat-FP sc组和Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组均出现了CD4+/CD8+比值的显著性升高,同时IFN-γ的水平显著升高,而CTL细

关键词： Tat融合蛋白 HIV-1疫苗安全性评价 SD大鼠

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LT-Y008的骨髓保护作用及机制

中国药理学与毒理学杂志 2013年第3期 473-474页

作者：孙旖夏振娜袁伯俊张晓芳陆国才第二军医大学药物安全性评价中心

目的研究LT-Y008对环磷酰胺致大鼠骨髓损伤和辐射致小鼠骨髓损伤的保护作用及机制。方法 (1)LT-Y008对大鼠骨髓损伤的保护作用:SD大鼠,按体重随机分为正常组,模型组,阳性组,LT-Y008处理组(125,250和500μg·kg-1),各组给药5 d后,再用环... 详细信息

目的研究LT-Y008对环磷酰胺致大鼠骨髓损伤和辐射致小鼠骨髓损伤的保护作用及机制。方法 (1)LT-Y008对大鼠骨髓损伤的保护作用:SD大鼠,按体重随机分为正常组,模型组,阳性组,LT-Y008处理组(125,250和500μg·kg-1),各组给药5 d后,再用环磷酰胺(CP,50 mg·kg-1)造模3 d。造模后d 5,d 10进行血液学和血液生化学检测,并进行组织学检查及骨髓细胞分类计数;卫星组动物分别在d-2(造模前2 d),d 1,d 3,d 5,d7,d 10,d 14,d 17进行血液学监测。(2)LT-Y008对小鼠骨髓损伤的保护作用:ICR小鼠,按体重随机分为正常组,模型组,阳性组,LT-Y008处理组(250,500和1000μg·kg-1),各组给药3 d,接受6 Gy或7 Gy 60 Co辐射造模。造模后d 3,d 14分别解剖1/2小鼠,取脏器称重,进行骨髓细胞分类计数;卫星组在造模后d 1,d 3,d 5,d 7,d 10,d 14,d 17进行血液学检测,每天观察小鼠存活情况并记录死亡时间。(3)LT-Y008的骨髓保护机制:检测血浆中SOD,TNFα和IL-1β水平;Western blotting法检测磷酸化P65和P50含量;EMSA法检测小鼠骨髓细胞内活化NF-κB与DNA结合的能力。结果 (1)大鼠实验:与正常组比,阳性组、模型组和500μg·kg-1组体重均降低;阳性组和500μg·kg-1组大鼠的WBC,HGB,#MONO,%MONO,%NEUT,#LYMPH,%RETIC,RBC,PLT等指标均显著升高,显示出一定骨髓保护作用;阳性组与处理组TBIL低于模型组;CP可导致大鼠胸腺和脾脏重量降低,阳性药和LT-Y008对胸腺有保护作用;500μg·kg-1组与阳性组骨髓细胞增生。(2)小鼠实验:与正常组比,模型组体重降低,阳性组和处理组体重无显著变化,且其WBC,PLT,%NEUT,%MONO,%LYMPH,%RETIC比模型组高,且小鼠尾部红肿,提示可能有炎症;各组(除正常组外)胸腺、脾脏和肝脏重量显著降低,处理组比模型组略高;模型组和处理组骨髓细胞比正常组明显增多;与模型组相比,500μg·kg-1组和阳性组存活时间延长,存活率显著增加。(3)机制研究:与正常组比,模型组MnSOD显著降低,阳性组和处理组水平升高;d 3时,模型组TNFα,IL-1β显著升高,阳性组和处理组水平显著减低,d 14时模型组降低,阳性组和处理组升高;模型组小鼠骨髓细胞磷酸化P65和P50明显升高,阳性组和处理组低于模型组;模型组活化NF-κB与DNA的结合能力升高,阳性组和处理组低于模型组。结论 LT-Y008对CP导致的大鼠和小鼠的骨髓损伤有一定保护作用,能拮保护CP对血液系统的损伤,延长小鼠生存时间。LT-Y008的骨髓保护作用可能与减轻机体氧化应激水平,提高MnSOD,提高对过度炎症反应的应急阈值,适度激活NF-κB通路有关,可提高机体对化疗和放疗后对骨髓损伤的保护作用。

关键词： LT-Y008 LTα 骨髓保护环磷酰胺辐射

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结肠参与慢性肾功能衰竭大鼠氧化应激的激活

第二军医大学学报 2019年第1期40卷 43-48页

作者：郭织运李和文夏振娜许静董睿海军军医大学(第二军医大学)长海医院肾内科上海200433 解放军第五医院心肾内科银川750000 海军军医大学(第二军医大学)药物安全检测中心上海200433

目的探讨慢性肾功能衰竭(CRF)胃肠道症状的发生机制,明确结肠是否参与CRF氧化应激的激活。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组(10只)和CRF组(20只),CRF组大鼠予以5/6肾切除建立CRF模型,对照组仅打开肾包膜后缝合。成模后10周处死大鼠,... 详细信息

目的探讨慢性肾功能衰竭(CRF)胃肠道症状的发生机制,明确结肠是否参与CRF氧化应激的激活。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组(10只)和CRF组(20只),CRF组大鼠予以5/6肾切除建立CRF模型,对照组仅打开肾包膜后缝合。成模后10周处死大鼠,收集2组大鼠的血清及回盲瓣附近结肠组织。检测大鼠肾功能指标血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)以评估造模是否成功,检测大鼠血清及结肠组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAC)和8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)以评估氧化应激水平,检测泛素细胞色素C诱导核心蛋白酶Ⅰ(UQCRC1)mRNA和蛋白水平以评估线粒体功能。结果与对照组相比,CRF组血清BUN及SCr水平升高,提示造模成功;CRF组血清及结肠组织中MDA水平升高(P0.05);CRF组结肠组织中UQCRC1蛋白水平较对照组低(P0.05)。结论 CRF大鼠的结肠组织中存在氧化与抗氧化反应失衡现象,其机制可能涉及线粒体的功能障碍。

关键词：慢性肾功能衰竭胃肠道功能障碍氧化性应激线粒体

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药物安全药理学研究新进展

中国新药杂志 2010年第15期19卷 1309-1313页

作者：车爱萍王洁夏振娜姜华袁伯俊陆国才第二军医大学新药评价中心上海200433

安全药理学主要研究药物及其代谢产物对心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统等的影响。通过安全药理学研究,确定药物可能关系到人安全性的非期望药理作用;评价药物在毒理学和/或临床研究中所观察到的药物不良反应和/或病理生理作用;研... 详细信息

安全药理学主要研究药物及其代谢产物对心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统等的影响。通过安全药理学研究,确定药物可能关系到人安全性的非期望药理作用;评价药物在毒理学和/或临床研究中所观察到的药物不良反应和/或病理生理作用;研究所观察到的和可疑的药物不良反应机制。近年来安全药理学研究发展迅速,生物信号遥测系统可用来检测清醒状态下、自由活动动物的多种生理指标;对药物引起的QT间期延长应进行综合风险评估已是共识;计算机毒性预测、人心肌干细胞研究、下丘脑病理组织切片研究、用斑马鱼进行高通量筛选、安全药理学生物标志物探索为准确预测药物的临床毒性奠定了基础。

关键词：安全药理学遥测系统 QT间期心肌干细胞生物标志物

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分子影像技术在药物研发中的应用

中国新药杂志 2010年第13期19卷 1116-1120页

作者：夏振娜车爱萍王洁袁伯俊毛煜陆国才第二军医大学新药评价中心上海200433

分子影像可在活体状态下对生物和生化过程进行无创研究。该技术包括分子探针和分子成像技术,可通过特异性探针或报告基因成像。运用分子影像技术可筛选侯选化合物,评价药物对肿瘤代谢、增殖、血管发生和凋亡的影响,评价药物对组织缺氧... 详细信息

分子影像可在活体状态下对生物和生化过程进行无创研究。该技术包括分子探针和分子成像技术,可通过特异性探针或报告基因成像。运用分子影像技术可筛选侯选化合物,评价药物对肿瘤代谢、增殖、血管发生和凋亡的影响,评价药物对组织缺氧的影响。分子影像技术是药物作用机制研究的重要手段,将大大加快药物研发进程。

关键词：分子影像药物研发肿瘤

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构建行政事业单位和谐内部审计的思考

沿海企业与科技 2010年第7期 21-22页

作者：夏振娜王海燕威海市工商行政管理局威海市工商行政管理局财装科

随着财务工作信息化的快速发展,内部审计作为重要的组成部分,越来越凸显其在监督管理中的重要作用,并且财务工作往往动一发而牵全身。因此,以内审为抓手,规范财务工作的健全有效性刻不容缓。文章由行政事业单位内审现状延伸思考构建完... 详细信息

随着财务工作信息化的快速发展,内部审计作为重要的组成部分,越来越凸显其在监督管理中的重要作用,并且财务工作往往动一发而牵全身。因此,以内审为抓手,规范财务工作的健全有效性刻不容缓。文章由行政事业单位内审现状延伸思考构建完善的内审体系,旨在提高行政事业单位财务审计工作的全面性。

关键词：内部审计行政事业单位体系

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中药毒代动力学研究进展

中国新药杂志 2015年第21期24卷 2448-2452,2458页

作者：高方圆袁伯俊马秀娟夏振娜陆国才第二军医大学药物安全性评价中心上海200433

中药尤其是复方中药的效毒物质基础多元、复杂,难以明确甚至不明,因此中毒现象时有发生。中药毒代动力学作为中药安全性评价研究中的重要部分,能够有效解释毒性试验结果和预测人体安全性,是连接毒理试验现象和人用中药可能发生的不良反... 详细信息

中药尤其是复方中药的效毒物质基础多元、复杂,难以明确甚至不明,因此中毒现象时有发生。中药毒代动力学作为中药安全性评价研究中的重要部分,能够有效解释毒性试验结果和预测人体安全性,是连接毒理试验现象和人用中药可能发生的不良反应评价之间的桥梁。但目前中药毒代动力学发展缓慢,存在许多瓶颈问题。解决中药毒代动力学的发展障碍,明确其效毒物质基础是关键。本文从中药毒代动力学的研究目的及意义、研究方法、困难与挑战和解决方法四方面进行了综述。

关键词：中药毒代动力学研究毒性机制转化医学

复方硫辛酸口服和灌胃给药4周对Beagle犬和SD大鼠的毒性病理学观察

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复方硫辛酸口服和灌胃给药4周对Beagle犬和SD大鼠的毒性病理学观察

2015年（第五届）药物毒理学年会

作者：陈云戴益民夏振娜陆国才中国人民解放军第二军医大学热卫系卫生毒理学教研室

＜正＞目的观察Beagle犬口服、SD大鼠灌胃给药复方硫辛酸后对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的程度。方法分别给Beagle犬口服、SD大鼠灌胃给药复方硫辛酸高、中、低剂量,并设溶媒对照和硫辛酸及尼莫地平两组阳...

＜正＞目的观察Beagle犬口服、SD大鼠灌胃给药复方硫辛酸后对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的程度。方法分别给Beagle犬口服、SD大鼠灌胃给药复方硫辛酸高、中、低剂量,并设溶媒对照和硫辛酸及尼莫地平两组阳性对照。给药期结束28天、恢复期结束42天解剖动物,称取脏器重量,计算脏体比值;进行60只犬和180只大鼠全身脏器的病理组织学检查。结果①Beagle犬脏器系数:与溶媒对照组相比,两阳性对照组给药期结束（d28天停药）睾丸绝对重量明显降低;中剂量组停药

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来源： cnki会议评论

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LT-Y008的骨髓保护作用及机制

LT-Y008的骨髓保护作用及机制