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耐热赖氨酸氨肽酶的原核表达及特性表征

食品与生物技术学报 2019年第12期38卷 110-115页

作者：黄浩周楠迪田亚平江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

铜绿假单胞菌NJ-814(Pseudomonas aeruginosa NJ-814)所产氨肽酶具有良好的热稳定性。克隆出该氨肽酶编码基因(lap),测序得知该基因长度为1461 bp,编码486个氨基酸。将lap与表达载体pET-42a(+)连接构建重组基因pET-42a-lap,重组基因转... 详细信息

铜绿假单胞菌NJ-814(Pseudomonas aeruginosa NJ-814)所产氨肽酶具有良好的热稳定性。克隆出该氨肽酶编码基因(lap),测序得知该基因长度为1461 bp,编码486个氨基酸。将lap与表达载体pET-42a(+)连接构建重组基因pET-42a-lap,重组基因转化进入原核表达宿主*** BL21(DE3)构建重组菌BLAP,BLAP在16℃低温诱导下成功表达出重组氨肽酶。通过镍柱(Ni-NTA)亲和层析对重组酶进行分离纯化,得到电泳纯的重组酶酶液,纯化倍数和回收率分别为4.7和83.5%。考察该重组氨肽酶的酶学特性,发现该酶的最适pH为8.3,在pH 6.5~9.5之间具有较好的稳定性;最适反应温度为80℃,经过70℃热处理1 h仍能保留60%以上的酶活性;底物特异性研究表明该重组酶能够水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA,对Lys-pNA的水解能力分别是其他2种的6.6倍和2.4倍,通过酶动力学分析证实了该酶对赖氨酸底物具有最强的亲和力,与野生菌所产的酶一致属于一种赖氨酸氨肽酶。

关键词：赖氨酸氨肽酶热稳定性原核表达酶学特性

高抑菌活性物质产生菌的选育、优化及其特性表征

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食品与生物技术学报 2019年第10期38卷 144-151页

作者：李勋周楠迪田亚平江南大学工业生物技术教育部重点实验室

以发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力作为指标,从实验室保藏菌株中筛选出一株产抑菌活性物质水平较高的菌株JN-814C,经鉴定其为地衣芽孢杆菌。进一步研究该菌株产生与分泌细菌素的特性,确定其最适培养基为糊精2.5 g/L,酵母粉7.5 g/L,胰... 详细信息

以发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力作为指标,从实验室保藏菌株中筛选出一株产抑菌活性物质水平较高的菌株JN-814C,经鉴定其为地衣芽孢杆菌。进一步研究该菌株产生与分泌细菌素的特性,确定其最适培养基为糊精2.5 g/L,酵母粉7.5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化钠3 g/L,最佳培养条件为培养时间22 h,培养温度37℃,初始pH 7.0,装液量50 mL,接种量2%。通过硫酸铵分级沉淀与DEAE-Sepharose-FF阴离子交换层析可初步纯化得到抑菌活性物质样品。纯化后的抑菌物质对革兰氏阳性菌有较好的拮抗性,对样品进行蛋白酶处理与氨基酸分析,发现其对碱性蛋白酶敏感,组成中谷氨酸含量较高,对温度、酸碱的敏感性较低,因此可基本被确定为一种抑菌肽。

关键词：地衣芽孢杆菌细菌素发酵优化分离纯化特性

芥子酸及其衍生物对酪氨酸酶抑制作用的电化学研究

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高等学校化学学报 2008年第2期29卷 273-276页

作者：张冬梅周楠迪周卉陈亭李根喜南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室南京210093 上海大学生命科学学院上海市能源作物育种及应用重点实验室上海200444

采用电化学方法研究了芥子酸、芥子酸甲酯及芥子碱对酪氨酸酶的抑制作用．结果发现，酪氨酸酶电极对其底物邻苯二酚有良好的电催化作用，电流响应在底物1．0×10^-7～6．0×10^-5moL／L的浓度范围内呈线性关系，并具有较高的灵敏度（60... 详细信息

采用电化学方法研究了芥子酸、芥子酸甲酯及芥子碱对酪氨酸酶的抑制作用．结果发现，酪氨酸酶电极对其底物邻苯二酚有良好的电催化作用，电流响应在底物1．0×10^-7～6．0×10^-5moL／L的浓度范围内呈线性关系，并具有较高的灵敏度（60．93nA·L／μmol）；芥子酸及其衍生物都对酪氨酸酶的活性有抑制作用，抑制能力大小的顺序为芥子酸〉芥子酸甲酯〉芥子碱．通过对这3种物质的抑制参数的计算结果表明，芥子碱是非竞争型抑制，而芥子酸和芥子酸甲酯是混合型抑制．这3种物质对酪氨酸酶可能的抑制机理一是抑制物与底物竞争酶的双铜活性中心；二是抑制物具有抗氧化活性，因而抑制酶对底物的催化反应．

关键词：酪氨酸酶化学修饰电极芥子酸芥子酸甲酯芥子碱

球毛壳菌α-葡聚糖酶的异源表达、纯化及特性表征

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食品与生物技术学报 2021年第11期40卷 30-38页

作者：顾莉莉周楠迪田亚平江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

利用毕赤酵母密码子偏好性优化合成球毛壳菌α-葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。通过高拷贝筛选和摇瓶发酵条件的单因素优化,重组α-葡聚糖酶的酶活力由初始的2.692 U/mL提高至47.915 U/mL。选择Hitrap Q HP和Hitrap SP... 详细信息

利用毕赤酵母密码子偏好性优化合成球毛壳菌α-葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。通过高拷贝筛选和摇瓶发酵条件的单因素优化,重组α-葡聚糖酶的酶活力由初始的2.692 U/mL提高至47.915 U/mL。选择Hitrap Q HP和Hitrap SP HP的双步层析分离将发酵粗酶液纯化至电泳纯,纯化倍数40.83,比活达277.61 U/mg,回收率为24.15%。纯酶最适温度和pH分别为60℃和5.5。在20~50℃和pH为4.5~8.5范围内稳定性良好,浓度为10 mmol/L的Fe^(2+)对酶有激活作用,Cu^(2+)浓度(0.1~10 mmol/L)越高对酶的抑制作用越强。酶动力学实验发现该重组酶对高相对分子质量的底物亲和力更高,葡聚糖T2000为该酶的最适底物。

关键词： α-葡聚糖酶毕赤酵母离子交换电泳特性表征

钙离子对HRPC结构和电催化活性影响的研究

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无机化学学报 2008年第7期24卷 1089-1093页

作者：周楠迪朱彤阳黄吟曦刘山莉上海大学生命科学学院生物传感技术实验室上海200444 南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室南京210093

通过比较辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)中Ca2+移除前后的HRPC的光谱和电化学特性,阐明了Ca2+的存在对HRPC的重要作用。移除Ca2+后HRPC的紫外-可见吸收光谱发生了变化,Soret带的最大特征吸收峰以及α带和β带特征吸收峰均发生不同程度的... 详细信息

通过比较辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)中Ca2+移除前后的HRPC的光谱和电化学特性,阐明了Ca2+的存在对HRPC的重要作用。移除Ca2+后HRPC的紫外-可见吸收光谱发生了变化,Soret带的最大特征吸收峰以及α带和β带特征吸收峰均发生不同程度的蓝移和峰强减弱,表明其血红素微环境及结构发生了变化。移除Ca2+后的HRPC也可在与聚L型赖氨酸共修饰的石墨电极上表现出对H2O2的催化响应,但是天然HRPC比去除Ca2+后的HRPC对H2O2表现出更低的检测限,更宽的检测范围,更高的灵敏度以及更好的稳定性。实验结果表明,Ca2+对HRPC血红素微环境的保持、催化活性和稳定性均有重要的作用。

关键词：生物电化学辣根过氧化物酶同工酶C 钙离子

适应新工科特色的《食品发酵技术》线上教学模式探索与反思

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食品与发酵工业 2022年第3期48卷 325-330页

作者：陈磊周楠迪陈鹏程江南大学生物工程学院江苏无锡214122

为适应新工科特色的专业建设,《食品发酵技术》这门知识点多、交叉性强、覆盖面广的课程在教学内容的扩展、知识体系的构建、教学方式的更新和教学资源的网络化等方面都有进一步的提升空间。基于《食品发酵技术》课程线下教学过程中存... 详细信息

为适应新工科特色的专业建设,《食品发酵技术》这门知识点多、交叉性强、覆盖面广的课程在教学内容的扩展、知识体系的构建、教学方式的更新和教学资源的网络化等方面都有进一步的提升空间。基于《食品发酵技术》课程线下教学过程中存在的问题,为贯彻"成果导向教育(Outcome Based Education,OBE)"理念,落实课程思政要求,结合课程特点和"新冠"疫情期间线上教学模式的探索,对该课程的进一步改革和完善进行了深入反思。在此基础上,对教改前后学生评价结果进行总结分析,以人为本,使课程建设更加符合新工科专业建设的要求。

关键词：新工科食品发酵技术线上教学教学模式改革

紫菜酶解产物锌螯合-α-葡萄糖苷酶抑制剂活性肽的研究

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食品与生物技术学报 2019年第4期38卷 143-149页

作者：胡春芹龙婧周楠迪田亚平江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

研究紫菜酶解α-葡萄糖苷酶抑制活性肽与锌螯合反应的条件,并对锌-螯合-糖苷酶抑制剂活性肽的胃肠消化稳定性进行评价。对条斑紫菜在一定条件下进行内切与外切蛋白酶的复合酶解获得具备α-葡萄糖苷酶高抑制活性的多肽,采用超滤纳滤双膜... 详细信息

研究紫菜酶解α-葡萄糖苷酶抑制活性肽与锌螯合反应的条件,并对锌-螯合-糖苷酶抑制剂活性肽的胃肠消化稳定性进行评价。对条斑紫菜在一定条件下进行内切与外切蛋白酶的复合酶解获得具备α-葡萄糖苷酶高抑制活性的多肽,采用超滤纳滤双膜组合分离后旋转蒸发浓缩冻干,获得的多肽质量浓度为1 mg/mL时对0.5 mg/mL的α-葡萄糖苷酶抑制率达68%;利用α-葡萄糖苷酶抑制活性肽与锌溶液反应进行螯合条件优化,螯合的最佳条件为:时间1.5 h,pH4.5,温度37℃,质量浓度6 mg/mL,得到的锌-螯合-糖苷酶抑制剂活性肽溶液螯合度为25.6%,螯合后对α-葡萄糖苷酶抑制活性提高到79.8%;建立体外胃肠消化模型,以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,评价制备的锌-螯合-糖苷酶抑制剂活性肽的胃肠消化耐受性,结果表明:经过不同酶与底物比、时间胃消化后α-葡萄糖苷酶抑制活性下降均在7%左右,十二指肠消化后,抑制活性下降均在5%以内,具有良好的胃肠消化稳定活性。

关键词：紫菜酶解肽 α-葡萄糖苷酶抑制剂螯合锌稳定性

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重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

无锡轻工大学学报（食品与生物技术） 2004年第2期23卷 8-11页

作者：邵玲莉周楠迪吴奇凡金坚田亚平江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达... 详细信息

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.

关键词：人血管抑素重组大肠杆菌发酵条件 pQE32-AGN 产物表达

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第7期35卷 730-738页

作者：巫朦朦蔡蓉凤田亚平周楠迪江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室

肠球菌(Enterococcus)是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术... 详细信息

肠球菌(Enterococcus)是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX),从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数(Kd)测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其K_d值为549.2±147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。

关键词：粪肠球菌适配体指数富集的配体系统进化技术荧光分析法解离常数