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核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

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江苏农业科学 2010年第4期38卷 25-28页

作者：周晓婴陈松戚存扣南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性。目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PG IP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体。本研究... 详细信息

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性。目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PG IP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体。本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上。以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG。用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒。经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功。应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库。

关键词：核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因酵母双杂交克隆诱饵蛋白载体

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1的SSH文库构建

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中国油料作物学报 2011年第2期33卷 157-161页

作者：周晓婴陈松戚存扣江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正... 详细信息

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cD-NA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。

关键词：甘蓝型油菜核盘菌抑制消减杂交 cDNA文库

油菜(Brassica napus L.)BnPGIP基因克隆及其表达分析

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江苏农业学报 2011年第3期27卷 488-493页

作者：周晓婴陈松戚存扣江苏省农业科学院经济作物研究所国家油菜改良中心南京分中心江苏南京210014

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公... 详细信息

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99%,编码区序列全长984 bp,编码332个氨基酸,富含亮氨酸。以翻译延伸因子EF-1α作为内标,利用半定量RT-PCR分析了BnPGIP基因在核盘菌未诱导和诱导后宁RS-1中的表达量差异。结果发现,核盘菌诱导后宁RS-1中的BnPGIP表达含量明显提高,表明宁RS-1在受到核盘菌侵染后体内的BnPGIP基因受到诱导表达。为进一步研究BnPGIP基因在抗核盘菌侵染的作用,构建了BnPGIP基因过量表达载体。

关键词：甘蓝型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆表达

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长江下游甘蓝型油菜种质耐湿性鉴定

江苏农业科学 2023年第6期51卷 79-86页

作者：高建芹陈锋龙卫华张维周晓婴江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

渍害是长江下游多发性气象灾害,严重影响油菜产量。通过对适合长江下游种植的60份甘蓝型油菜种质进行耐渍性筛选,为耐渍性品种选育和生产者选择品种提供依据。在露白期和子叶期进行室内淹水处理,考察油菜种质的耐渍性及耐渍性指标。结... 详细信息

渍害是长江下游多发性气象灾害,严重影响油菜产量。通过对适合长江下游种植的60份甘蓝型油菜种质进行耐渍性筛选,为耐渍性品种选育和生产者选择品种提供依据。在露白期和子叶期进行室内淹水处理,考察油菜种质的耐渍性及耐渍性指标。结果表明,淹水后油菜的相对成苗率、相对茎长、相对根长和相对单株鲜质量均不同程度下降。不同种质的耐渍性差异较大,同一品种在不同时期淹水耐渍性也有差异,受试材料中强耐渍的材料有3份(P1、P39和P47),占总品种的5%;较强耐渍的材料11份(P5、P7、P12、P17、P24、P25、P26、P27、P29、P33和P42),占18.3%。依据上述2种方法的筛选结果,选取9份材料进行田间鉴定。结果表明,3叶期渍害处理后,单株有效分枝数、有效角果数、每角粒数及产量下降,千粒质量增加,P1、P39和P47表现突出,受淹水时期影响较小,与露白期、子叶期的鉴定结果高度一致。相关性分析表明,不同种质苗期各性状湿害指标与成熟期产量性状相关性大部分达到显著或极显著水平,有利用潜力。综上,通过室内淹水处理,考察油菜种子的相对成苗率和相对根长可便捷有效地鉴定甘蓝型油菜耐湿性,提高筛选效率。

关键词：甘蓝型油菜耐渍性耐渍性指标

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

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江苏农业学报 2014年第1期30卷 14-20页

作者：申爱娟陈松周晓婴戚存扣南京农业大学农学院江苏南京210095 国家油料作物改良中心南京油菜分中心江苏南京210014 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室江苏南京210014

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为2... 详细信息

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含A/T区。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计的2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485 bp和405 bp预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达到0.1%。表明应用该技术可对W-4转基因事件进行特异性检测。

关键词：转基因油菜旁侧序列事件特异性检测

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转基因高油酸油菜株系W-4种子脂肪酸组成

中国油料作物学报 2015年第2期37卷 129-133页

作者：陈松彭琦高建芹周晓婴张维张洁夫浦惠明戚存扣江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014 国家油菜改良中心南京分中心江苏南京210014 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室江苏南京210014

为研究fad2基因下调表达对油菜种子脂肪酸组成的影响,分析比较了转基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7种子以及非转基因对照Westar种子中的脂肪酸组成。数据显示W-4种子中油酸平均含量为84.61%±1.41%,较对照增加了25.91%,达到极显著水... 详细信息

为研究fad2基因下调表达对油菜种子脂肪酸组成的影响,分析比较了转基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7种子以及非转基因对照Westar种子中的脂肪酸组成。数据显示W-4种子中油酸平均含量为84.61%±1.41%,较对照增加了25.91%,达到极显著水平;亚油酸和亚麻酸含量分别为3.22%±0.56%和3.45%±0.51%,较对照分别下降了80.89%和47.00%,降幅均达极显著水平。此外,W-4种子中棕榈酸平均含量为3.42%±0.18%,较对照Westar下降18.10%,达到极显著水平;而硬脂酸平均含量为1.87%±0.19%,较对照下降了8.33%,亦达到显著水平;W-4种子中廿碳烯酸的平均含量为1.54%±0.06%,较对照平均增幅为18.46%,达到极显著水平;W-4平均芥酸含量较对照略有增加,但不显著。结果表明油菜种子中fad2基因下调表达对种子的脂肪酸合成与积累影响较大,其不仅显著降低种子中多不饱和脂肪酸含量,增加油酸的含量;而且也显著降低饱和脂肪酸含量,并促进长链单烯酸的合成。

关键词：转基因油菜高油酸脂肪酸组成

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甘蓝型油菜离体培养再生体系的优化

江苏农业科学 2016年第7期44卷 76-79页

作者：郭婷婷周晓婴张维陈锋彭琦陈松张洁夫南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院经济作物研究所1农业部长江下游棉花与油菜重点实验室江苏南京210014

为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系,本研究分析了影响再生频率的多个关键因素,包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。结果表明:品种对再生频率影响较大,Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号;不同外... 详细信息

为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系,本研究分析了影响再生频率的多个关键因素,包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。结果表明:品种对再生频率影响较大,Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号;不同外植体再生频率也存在差异,子叶柄的再生频率显著高于下胚轴;苗龄以4 d较好,预培养时间以2 d较适宜;预培养基中激素2,4-D最适浓度为1 mg/L,分化培养基中,6-BA/NAA比例为10∶1时子叶柄的再生频率最高,为70.79%,6-BA/NAA比例为9∶1时下胚轴的再生频率最高,达到96.73%。经过优化后,油菜外植体再生频率得到显著提高。

关键词：油菜离体培养再生优化影响因素

转基因甘蓝型油菜品系W-4高油酸性状遗传分析

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江苏农业学报 2013年第2期29卷 261-265页

为研究转基因甘蓝型油菜(Brassica napus L.)高油酸品系W-4的高油酸性状的遗传,用W-4(P1)及其野生型Westar(P2)为亲本,配置正反杂交组合,衍生获得F1、RF1、F2、RF2,B1、B2和RB1、RB2等世代群体。应用气相色谱定量分析方法,检测亲本及衍... 详细信息

为研究转基因甘蓝型油菜(Brassica napus L.)高油酸品系W-4的高油酸性状的遗传,用W-4(P1)及其野生型Westar(P2)为亲本,配置正反杂交组合,衍生获得F1、RF1、F2、RF2,B1、B2和RB1、RB2等世代群体。应用气相色谱定量分析方法,检测亲本及衍生世代群体成熟种子中油酸含量;同时,在苗期检测各个世代群体对卡那霉素(Kan)抗性的反应。结果显示:W-4种子中油酸平均含量为(85.10±0.73)%,Westar为(62.16±3.68)%;F1、RF1群体油酸平均含量分别为(77.55±1.30)%和(77.34±2.46)%,均表现为高油酸含量(≥69.5%),无细胞质效应;B1、RB1群体全部表现为高油酸(≥69.5%)。B2、RB2群体中,高油酸个体分别为55个和52个,低油酸个体分别为45个和48个,均呈1∶1分离(χ2=1.00,χ2=0.16);F2、RF2分离群体中,高油酸与低油酸个体呈3∶1分离(χ2=0.96,χ2=0.11)。表明,P1的高油酸性状受1对显性基因控制,呈孟德尔遗传,无细胞质遗传效应。此外,苗期Kan抗性检测结果表明,P1、F1、RF1、B1、RB1群体植株对Kan反应均表现为抗;P2对Kan反应表现为感;B2、RB2群体中抗、感植株呈1∶1分离,F2、RF2群体中抗、感植株呈3∶1分离。表明P1的卡那霉素抗性受1对显性基因控制。

关键词：转基因油菜高油酸遗传

甘蓝型油菜CRABS CLAW基因克隆及其RNA干扰载体的构建

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江苏农业学报 2015年第4期31卷 737-742页

作者：周晓婴付三雄陈松张超戚存扣国家油菜改良中心南京分中心江苏南京210014 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室江苏南京210014 江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

CRABS CLAW(CRC)转录因子是YABBY基因家族成员,在植物花器官发育过程中起重要作用。为进一步研究CRC转录因子在调控油菜花器官发育过程中的作用,本研究以甘蓝型油菜品种宁油10号花蕾RNA为材料,通过反转录PCR克隆到1个580 bp长度的CRC基... 详细信息

CRABS CLAW(CRC)转录因子是YABBY基因家族成员,在植物花器官发育过程中起重要作用。为进一步研究CRC转录因子在调控油菜花器官发育过程中的作用,本研究以甘蓝型油菜品种宁油10号花蕾RNA为材料,通过反转录PCR克隆到1个580 bp长度的CRC基因,并利用p Hurricane中间载体构建CRC基因的反向重复序列表达框,将CRC基因片段以正向的方式连接在1个可剪切的内含子的5'末端,以反向的方式连接到该内含子的3'末端;然后将Ca MV35S启动子序列和CRC基因的反向重复表达框再克隆到植物双元载体p CAMBIAI1390的p UC18多克隆位点,构建了干扰表达载体p A6-CRCi,经过酶切鉴定和测序分析,所构建的载体正确。

关键词：油菜 CRABSCLAW基因 RNA干扰载体