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西北地区羊种布鲁氏菌遗传相关性分析

中国人兽共患病学报 2024年

作者：曹小安刘志杰刘萍吴锦艳尚佑军何继军刘志国李振军中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物安全实验室传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室

目的调查西北地区羊源布鲁氏菌的种型、分布及遗传相关性,揭示西北地区羊种布鲁氏菌种群和流行特征。方法用常规鉴定和AMOS-PCR对西北4省区的13个地区分离的布鲁氏菌进行种型鉴定,采用MLST和MLVA-16分型方法对菌株进行基因特征分析。... 详细信息

目的调查西北地区羊源布鲁氏菌的种型、分布及遗传相关性,揭示西北地区羊种布鲁氏菌种群和流行特征。方法用常规鉴定和AMOS-PCR对西北4省区的13个地区分离的布鲁氏菌进行种型鉴定,采用MLST和MLVA-16分型方法对菌株进行基因特征分析。结果常规鉴定和AMOS-PCR检测显示,本研究共分离羊种布鲁氏菌59株,其中22株来自内蒙古,17株来自新疆,13株来自甘肃,另有7株来自青海。羊种3型布鲁氏菌58株,羊种1型布鲁氏菌1株。MLST分析表明90%(53/59)的羊种布鲁氏菌为ST8序列型,为该地区主导流行种群。MLVA-11调查显示59株羊种布鲁氏菌聚为6个MLVA-11基因型,87%的菌株为MLVA-11基因116型,提示西北地区的流行菌株属于东地中海谱系。MLVA-16将59株羊种布鲁氏菌分为40个基因型,其中8个为共享基因型且每个基因型由2～7株来自相同地区的菌株构成,表明各共享基因型的病例由来自相同传染源引起的暴发流行。所有的共享ML VA-16基因型均由来自相同省区的菌株组成,提示各省区菌株呈现明显的地域聚集性特征。基于人群和羊脾分离菌株遗传比较显示,不同宿主来源的菌株组成多个完全相同的MLVA-16基因型,提示由羊到人的传播途径。结论羊种3型布鲁氏菌是西北地区动物布病的主要病原菌,疫羊是该区域人群布病的主要传染源。ST8克隆群是该地区的主导流行种群,各地区菌株MLVA基因型呈明显的地域聚集性特征。

关键词：羊种布鲁氏菌 MLST MLVA 遗传相关性西北地区

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2259-2266页

作者：李鹏飞高桂琴周广青吴锦艳颜新敏曹小安何继军袁莉刚尚佑军甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 白银市农业综合行政执法队白银730900

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在... 详细信息

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

关键词：山羊地方性鼻内肿瘤病毒羊内源性逆转录病毒 TaqMan 荧光定量RT-PCR

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猪圆环病毒2型LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 728-734页

作者：毛首会杜国玉刘晓波吴锦艳兰喜何继军尚佑军王桂琴刘永杰中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州1730046 宁夏大学农学院宁夏银川750021

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度... 详细信息

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度,经过特异性、灵敏度、重复性以及符合性验证,最终建立了快速检测PCV2的LAMP-CRISPR/Cas12a方法。结果显示,该方法最小检测量接近1 copy质粒DNA,灵敏度远高于本实验室常用的PCR方法,且在相同条件下只有PCV2呈阳性结果,其他均呈现阴性,表明特异性良好。同时该方法具有良好的重复性,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,该方法与qPCR之间的符合率较高,可通过肉眼观察在蓝光下的反应产物判断结果。结果表明,建立的LAMP-CRISPR/Cas12a体系适用于PCV2的快速检测。

关键词：猪圆环病毒2型 CRISPR/Cas12a检测环介导等温扩增

甘肃某羊场免疫布鲁菌病疫苗后绵羊流产原因的调查及分析

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1103-1110页

作者：刘志杰刘萍吴锦艳尚佑军何继军王子坚蔡江聂帅帅李鹏飞杜国玉苟惠天曹小安甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州川730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 甘肃省动物疫病预防控制中心甘肃兰州730046

应用疫苗免疫绵羊后,羊场依然出现大规模流产和不孕,为查明原因,收集该羊场31份流产羊和23份不孕羊的阴道分泌物拭子及其对应的羊血清进行检测。用竞争酶联免疫吸附试验(c ELISA)、布鲁菌抗体Ig G检测试验和试管凝集试验(SAT)检测血清;... 详细信息

应用疫苗免疫绵羊后,羊场依然出现大规模流产和不孕,为查明原因,收集该羊场31份流产羊和23份不孕羊的阴道分泌物拭子及其对应的羊血清进行检测。用竞争酶联免疫吸附试验(c ELISA)、布鲁菌抗体Ig G检测试验和试管凝集试验(SAT)检测血清;用荧光PCR做54份拭子流产相关的布鲁菌病、Q热和衣原体病的病原检测;对检测布鲁菌阳性的样本用AMOS-PCR进行布鲁菌种属鉴定,扩增利福平耐药基因(rpoB)并测序,将序列与其标准参考菌株比对后构建进化树。结果显示:用布鲁菌c ELISA检测54份血清,其中22份血清初筛阳性,阳性率为40.7%;SAT确诊其中16份样本为阳性,其中流产羊有6只阳性,阳性率为19.4%,不孕羊有10只阳性,阳性率为43.5%,总体阳性率为29.6%。用布鲁菌抗体Ig G检测试验检测感染的样本19份发现,流产羊有6只阳性,阳性率为19.4%,不孕羊有13只阳性,阳性率为56.5%,总体阳性率为35.2%。荧光PCR结果显示:拭子样本10份为布鲁菌阳性,阳性率为18.5%;12份为贝氏柯克斯体(Q热病原)阳性,阳性率为22.2%;衣原体阳性率为0。布鲁菌阳性样本AMOS-PCR扩增得到731 bp的条带,rpoB基因分析发现所有氨基酸序列都未发现利福平耐药突变,AMOS-PCR和rpoB基因系统进化树分析结果显示羊感染的为马耳他布鲁菌。结论:本场群发性流产的发生可能是由于布鲁菌病疫苗免疫失败后病原感染,并伴随着贝氏柯克斯体等病原的混合感染引起。

关键词：布鲁菌病 Q热流产 rpoB基因

猪口蹄疫病毒O/GS/WW/92株经不同宿主连续传代后3A基因的变异研究

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猪口蹄疫病毒O/GS/WW/92株经不同宿主连续传代后3A基因的变异研究

作者：吴锦艳甘肃农业大学

学位级别：硕士

不同动物宿主来源的FMD病毒,其非结构蛋白3A基因有较大的区别,与牛源毒相比几乎所有猪源毒的3A蛋白在第93～102位均有10个氨基酸发生缺失,而且这两种3A蛋白的病毒在对猪和牛的嗜性上存在明显的倾向性。国内有些学者认为猪口蹄疫流行毒... 详细信息

不同动物宿主来源的FMD病毒,其非结构蛋白3A基因有较大的区别,与牛源毒相比几乎所有猪源毒的3A蛋白在第93～102位均有10个氨基酸发生缺失,而且这两种3A蛋白的病毒在对猪和牛的嗜性上存在明显的倾向性。国内有些学者认为猪口蹄疫流行毒很可能起源于牛用弱毒活苗OMⅡ,然而这一结论也仅仅是通过测定大量的代表性(不同时期、地点和宿主来源)历史流行毒的Vp1序列进而分析毒株间的衍化关系而得出的,并没有关于3A演化进程的实验模型来直接佐证。对与OMⅡ遗传关系较为密切的历史毒株进行3A分析后发现,O/GS/WW/92猪源毒与OMⅡ的VP1、3A基因同源性高达97.7%和98.9%,而且其3A基因在第93～102位氨基酸区段出现连续4个氨基酸的缺失。鉴于此,本文选用与OMⅡ同源性极高的猪毒O/GS/WW/92为重点研究对象,通过在不同宿主细胞以及猪体上的连续传代,来人工预演口蹄疫病毒在定向跨种感染过程中3A基因的变异情况。实验结果显示:1)O/GS/WW/92经不同宿主(BHK-21上传110代、PK-15上传65代、猪体上传10代)连续传代后,其3A基因没有进一步发生类似自然流行毒的特征性缺失;2)将O/GS/WW/92在MD-BK细胞上连续盲传,发现该毒株不能感染MD-BK细胞;3)随着传代次数的增加,LD和TCID均有所升高;4)O/GS/WW/92的不同代次毒的VP1基因的核苷酸序列发生一系列碱基替换。由此可见:发生4个氨基酸缺失的口蹄疫病毒表现对猪的嗜性增强,对牛的嗜性减弱:O/GS/WW/92可能是牛毒向猪毒衍化过程中的一个过渡毒株;口蹄疫病毒经不同宿主传代后主要免疫原VP1基因突变是随机和非定向的,但从整体上系统地观察是有序的,基本保持了免疫基因的稳定性。

关键词：猪口蹄疫病毒 3A基因宿主嗜性缺失

RNAi实现方法及在免疫相关基因功能鉴定中的应用

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中国人兽共患病学报 2010年第11期26卷 1067-1070页

作者：魏衍全田宏吴锦艳尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内、外源双链RNA触发的.由19 - 23bp小分子干扰RNA片段(siRNA)诱导的同源性mRNA的降解,从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程.它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默,是生物体... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内、外源双链RNA触发的.由19 - 23bp小分子干扰RNA片段(siRNA)诱导的同源性mRNA的降解,从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程.它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及因重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制,同时也是一种真核生物体内的基因调控机制. 1995年康奈尔大学的Guo等~[1]尝试用反义RNA阻断线虫par-l基因的表达,结果发现反义RNA和正义RNA都阻断了基因的表达.直到1 998年 Fire等~[2]在进行线虫基因沉默研究中,分别注射肌肉蛋白的正义、反义和双链RNA,发现双链RNA的抑制效果是单链RNA的10到100倍.他们将这种双链RNA抑制基因表达的现象称为RNA干扰(RNAi),并因此获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖.此后,已陆续证明在真菌、线虫、果蝇、植物、动物等多种生物中都存在RNAi现象.以下从 siRNA如何在细胞内形成来介绍RNAi实现的方法以及RNAi在免疫相关基因功能研究中的最新应用进展

关键词：免疫相关基因功能鉴定 RNAi 转录后基因沉默 RNA干扰应用双链RNA RNA片段

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

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中国兽医科学 2012年第8期42卷 843-847页

作者：吴锦艳田宏陈妍尚佑军刘湘涛吴润甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆... 详细信息

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP9基因绿色荧光蛋白融合表达

猪瘟病毒复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性

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中国兽医科学 2011年第11期41卷 1144-1149页

作者：侯相民田宏吴锦艳陈妍尚佑军刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 兰州交通大学化学与生物工程学院甘肃兰州730070

为研究猪瘟病毒多表位疫苗,参照GenBank及文献中已发表的猪瘟病毒抗原表位,结合计算机分析软件进行优化和组合。将重组的多表位基因BT23人工合成克隆至pMD18-T质粒中,利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切并回收BT23基因,将BT23基因片段亚克隆插入p... 详细信息

为研究猪瘟病毒多表位疫苗,参照GenBank及文献中已发表的猪瘟病毒抗原表位,结合计算机分析软件进行优化和组合。将重组的多表位基因BT23人工合成克隆至pMD18-T质粒中,利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切并回收BT23基因,将BT23基因片段亚克隆插入pGEX-6P-1表达载体中,构建了猪瘟病毒复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT23,经酶切和测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,以终浓度为0.9mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达产物为融合蛋白,并且以包涵体形式存在,分子质量约36ku,表达产量约占菌体总蛋白的30%。Western-blot检测结果表明,表达的融合蛋白能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的反应原性。免疫攻毒试验结果表明,复合多表位融合蛋白具有免疫保护作用,这为应用该融合蛋白制备猪瘟病毒免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒复合多表位抗原基因融合表达活性分析

老师眼中的学困生——对一个民工子弟小学学生的个案分析

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文教资料 2006年第32期 90-92页

作者：吴锦艳浙江师范大学教育学院应用心理浙江金华321000

近年来,学习困难学生是社会、家庭、学校教育比较关注的一个问题。据调查,民工子女作为流动儿童,他们身上存在的学习困难问题尤为严重,本研究就导致民工子女产生学习困难的原因进行分析与讨论,旨在更深一步地了解民工子弟的学困问题,进... 详细信息

近年来,学习困难学生是社会、家庭、学校教育比较关注的一个问题。据调查,民工子女作为流动儿童,他们身上存在的学习困难问题尤为严重,本研究就导致民工子女产生学习困难的原因进行分析与讨论,旨在更深一步地了解民工子弟的学困问题,进而帮助他们摆脱困境。

关键词：学习困难民工子女流动儿童