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间质细胞mTOR信号通路活化加重CC14所致肝纤维化

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间质细胞mTOR信号通路活化加重CC14所致肝纤维化

作者：单兰兰南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景肝纤维化是全球发病率较高的疾病,它不是一个独立的疾病,许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化,包括慢性病毒性肝炎,酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝炎等。肝纤维化是指由各种致病因子所致肝损伤修复的过程伴随结缔组织异常增生,... 详细信息

一、研究背景肝纤维化是全球发病率较高的疾病,它不是一个独立的疾病,许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化,包括慢性病毒性肝炎,酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝炎等。肝纤维化是指由各种致病因子所致肝损伤修复的过程伴随结缔组织异常增生,以肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉积为特点的病理过程。越来越多的研究着眼于肝纤维化的病理机制,肌成纤维细胞(MF)以其合成并分泌胶原促进肝脏ECM的累积和收缩能力成为研究的热点。MF虽来源广泛,肝星状细胞(HSCs)依然是CC14所致的小鼠肝纤维化模型中肌成纤维细胞的主要来源。肝损伤时HSCs由静止的富含维生素的星状细胞活化为具有增殖、收缩和促纤维化能力的肌成纤维细胞,这样的细胞转变在理解肝纤维化发病机制的道路上具有划时代意义。HSCs不仅在肝损伤具有重要的功能,在肝发育、再生、异型生物质反应、代谢、免疫调节方面都发挥着重要的作用。与此同时,无数的研究利用组织免疫组织化学鉴定肝星状细胞,但迄今为止最具代表性的蛋白质包括平滑肌肌动蛋白(α -SMA)、结蛋白(desmin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其在体内由两种不同的复合物组成,分别是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)。mTORC1包括mTOR、Raptor、mLST8、PRAS40和Deptor;mTORC2包括mTOR、Rictor、 mSIN1、Protor-1、LST8和Deptor。结节性硬化复合物(TSC1/2)由TSC1和TSC2组成,对mTOR功能起负性调控作用,TSC1的缺失会导致组织细胞中mTOC1活性的持续激活。mTOC1可对细胞内外多种刺激产生应答反应,通过磷酸化其下游蛋白4EBP1和P70S6K,进而增加mRNA翻译效率,增加蛋白质合成,调控细胞生长和增殖。在一定条件下,通过雷帕霉素抑制mTORC1活性可以促进凋亡。mTOR的突变激活会引起凋亡抵抗,可能导致细胞转化。据报道,mTOR信号通路活化与多种纤维化疾病有关。mTOR信号通路在心肌纤维化中起重要作用,雷帕霉素作为mTOR信号通路抑制剂可以缓解心脏纤维化。雷帕霉素类似物SDZ和RAD对博莱霉素致小鼠肺纤维化模型中胶原积累有明显的抑制作用,抑制mTOR对肺纤维化有潜在的治疗作用。mTORC1信号信号通路可以促进肾成纤维细胞的活化,并有助于肾间质纤维化的发展。越来越多的证据支持mTOR信号通路在肝纤维化起重要作用。肝星状细胞激活是肝纤维化的发病机制中的关键步骤。肝星状细胞是位于Disse间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞的间质细胞。我们推测的mTOR信号通路在间充质细胞激活对肝纤维化有重要作用。二、研究方法1、基于Cre-loxp系统,我们成功构建了间质细胞特异性TSC1敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定。2、他莫昔芬诱导间质细胞特异性TSC1敲除小鼠,用western blot和免疫荧光确定TSC1敲除效果。3、采用四氯化碳(CC14)小鼠腹腔注射给药,模拟肝纤维化模型,对照组给予同等剂量甘油。检测小鼠血清的ALT,肝组织检测匀浆羟脯氨酸(HYP)。取肝组织进行HE和天狼星红染色,观察小鼠肝组织的损伤程度和胶原增生的情况。4、在小鼠动物模型,通过免疫组化及western blot方法,评估在间质细胞内mTOR过度活化情况下对肝纤维化形成的影响。5、通过对间质细胞特异性敲除TSC1mRNA分析,初步探讨mTORC1信号通路对促纤维化发生发展的基因的影响6、在小鼠动物模型,使用western blot检测及免疫荧光来评估小鼠肝组织内的增殖及凋亡水平变化情况。三、统计学处理所有数据均代表3次或以上重复实验的结果,以均数±标准误表示,每组数据使用t检验进行分析。检验水准：P<0.05有统计学意义。四、研究结果1、构建间质细胞特异性TSC1敲除小鼠,并对2月龄小鼠进行他莫昔芬诱导,使其产生敲除效果。纯合子TSC1小鼠(Tsc1fl/fl)与含有Cre-ER (T)重组酶基因的小鼠杂交繁殖出Cre/TSC1杂合的老鼠。经过第二代杂交繁殖出Cre酶阳性纯合子[TSC1fl/fl, ColⅠα2-CreER(T)+/0]和Cre酶阴性纯合子[TSC1fl/fl, ColIa2-CreER(T)0/0]小鼠。我们裂解鼠尾组织样本提取DNA,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。接着对2月龄的小鼠分别持续给予他莫昔芬8天,产生间质细胞特异敲除TSC1小鼠(TSC1 CKO)及对照野生型小鼠(WT)。给药1个月后取肝组织,通过western blot和免疫荧光验证敲除效果。肝组织匀

关键词：肝纤维化肌成纤维细胞条件性基因敲除哺乳动物雷帕霉素靶蛋白增殖凋亡

狗牙根颖果胚性愈伤组织的诱导和胚性细胞的超微结构及植株再生

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植物生理与分子生物学学报 2004年第2期30卷 209-215页

作者：谢海燕毛碧增单兰兰陈毓荃浙江大学生物技术研究所杭州310029 西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100

以普通狗牙根[Cynodon dactylon(L.)***.‘Suncity’]颖果为外植体,以MS为基本培养基,外加浓度在2.0-6.0mg/L的2,4-D,能高频率地诱导出高质量的胚性愈伤组织,其中以4.0 mg/L为最佳。胚性愈伤组织最佳继代及分化的培养方法为:用MS+2,4-D ... 详细信息

以普通狗牙根[Cynodon dactylon(L.)***.‘Suncity’]颖果为外植体,以MS为基本培养基,外加浓度在2.0-6.0mg/L的2,4-D,能高频率地诱导出高质量的胚性愈伤组织,其中以4.0 mg/L为最佳。胚性愈伤组织最佳继代及分化的培养方法为:用MS+2,4-D 4.0mg/L继代1-2次,然后转入1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L中继代1-2次,再在无激素的1/2 MS中光照培养10 d,最后在MS+6-BA 3.0 mg/L中诱导分化,分化成苗率达31.7％。经电镜观察发现,胚性愈伤组织结构紧密,细胞较小,内容物丰富,而非胚性愈伤组织结构疏松,细胞巨大,内含一大液泡,几无细胞器。

关键词：普通狗牙根颖果胚性愈伤组织再生植株超微结构

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盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立

细胞生物学杂志 2004年第6期26卷 645-648页

作者：毛碧增单兰兰范魏巍赵丽涵李德葆浙江大学生物技术研究所杭州310029

以非洲菊盆栽品种为材料,研究了BA和NAA不同浓度组合对不定芽诱导增殖的影响;基因枪介导法转化的不同轰击距离对转化率影响。结果表明:1.5 mg/L BA的培养基上增殖倍数最高,高达8.96倍;9 cm的目标轰击距离转化效率最高,达到10.9%。建立... 详细信息

以非洲菊盆栽品种为材料,研究了BA和NAA不同浓度组合对不定芽诱导增殖的影响;基因枪介导法转化的不同轰击距离对转化率影响。结果表明:1.5 mg/L BA的培养基上增殖倍数最高,高达8.96倍;9 cm的目标轰击距离转化效率最高,达到10.9%。建立了非洲菊盆栽品种的再生和转基因体系,为非洲菊基因工程育种打下基础。

关键词：盆栽非洲菊基因枪介导法基因转化体系培养基再生体系

学术自由:建设高水平大学之根本所在——对西南联大学术自由的办学理念之思考

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中国电力教育 2011年第26期 3-5页

作者：单兰兰东南大学高等教育研究所

学术自由是一个古老而又富有生命力的大学理念。学术自由精神是一所大学的生命。一所大学要永葆生机与活力,必须最大限度地实现学术自由。西南联大在我国高等教育史上堪称为一颗璀璨明珠,其学术自由是西南联大成功的最根本因素。对其进... 详细信息

学术自由是一个古老而又富有生命力的大学理念。学术自由精神是一所大学的生命。一所大学要永葆生机与活力,必须最大限度地实现学术自由。西南联大在我国高等教育史上堪称为一颗璀璨明珠,其学术自由是西南联大成功的最根本因素。对其进行分析研究,结合我国大学学术自由的现状,提出实现大学学术自由的一些基本构想,无疑对我国建设高水平大学有一定的裨益。

关键词：学术自由西南联大办学理念

规范化问卷问诊对健康管理医疗质量控制的作用

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中国老年学杂志 2016年第17期36卷 4344-4345页

作者：陈顺枝丁宇单兰兰丁燕吴洪渊傅友戴萌南方医科大学南方医院健康管理中心广东广州510515

目的：研究规范化问卷问诊对健康管理医疗质量控制的影响。方法对该院2014年1～5月8450人次和2015年1～5月9806人次实施“规范化问卷问诊”，并从健康管理医疗质量控制的角度对实施前后的相关资料进行统计分析和评价。结果实施“规范化... 详细信息

目的：研究规范化问卷问诊对健康管理医疗质量控制的影响。方法对该院2014年1～5月8450人次和2015年1～5月9806人次实施“规范化问卷问诊”，并从健康管理医疗质量控制的角度对实施前后的相关资料进行统计分析和评价。结果实施“规范化问卷问诊”后，一般健康风险因素的早期筛查率明显提高；常见慢性病早期筛查率提高；检查中不良事件发生率从2．02％下降到0．51％；放射检查符合率从76．69％提高到95．36％；疾病危险因素评估开展率从59．65％提高到95．38％。结论建立和实施规范化问卷问诊对提高健康管理医疗质量十分有效。

关键词：规范化问卷问诊健康管理质量控制

P-糖蛋白介导的中药-化学药相互作用研究进展

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中草药 2017年第15期48卷 3189-3197页

作者：杨珅珅刘安丽周倩单兰兰范思邈李遇伯天津中医药大学天津300193

中西药联合应用是临床治疗疾病的有效手段。中药作用持久温和,具有多成分、多靶点、多途径、整合调节的特点;化学药起效迅速,具有靶点明确、途径单一的特点,二者联合应用可优势互补、协同增效、降低毒副作用。P-糖蛋白是一种能量依赖型... 详细信息

中西药联合应用是临床治疗疾病的有效手段。中药作用持久温和,具有多成分、多靶点、多途径、整合调节的特点;化学药起效迅速,具有靶点明确、途径单一的特点,二者联合应用可优势互补、协同增效、降低毒副作用。P-糖蛋白是一种能量依赖型的跨膜转运蛋白,其介导的外排效应是药物传输的重要靶点。对P-糖蛋白的诱导或抑制作用是中西药联合应用时产生相互作用的重要因素。从P-糖蛋白水平对中药与化学药之间的相互作用进行了简要综述,以揭示P-糖蛋白在中西药联用中的作用,为临床中西药联用合理用药提供参考。

关键词： P-糖蛋白中药化学药中药-化学药相互作用中西药联合应用

UPLC-Q-TOF/MS结合数据后处理快速分类及鉴定丹参成分

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时珍国医国药 2019年第10期30卷 2408-2412页

作者：杨娜黄玮单兰兰段敬怡于红鑫杨珅珅李遇伯天津中医药大学

目的借助超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)结合数据后处理技术(特征性碎片和中性丢失)实现丹参中化学成分的快速分类及鉴定。方法使用UPLC-Q-TOF/MS仪器对样品进行分析,采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column色谱柱(... 详细信息

目的借助超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)结合数据后处理技术(特征性碎片和中性丢失)实现丹参中化学成分的快速分类及鉴定。方法使用UPLC-Q-TOF/MS仪器对样品进行分析,采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm),以0.05%甲酸水(A)和0.05%甲酸乙腈溶液(B)进行梯度洗脱。在正负离子模式下得到碎片信息,将获取的质谱图中碎片离子信息与之前查阅文献总结的不同类别化合物裂解产生的特征性碎片和中性丢失分子结合来进行目标化合物的快速鉴定和分类。结果最终鉴定出25个化学成分,其中包括萜类、酚酸类等。结论建立的方法实现了对丹参复杂化学成分的快速鉴定和分类,进一步的推进了中药化学成分研究方法的发展。

关键词：丹参特征性碎片中性丢失分子裂解规律 UPLC-Q-TOF/MS

宁波大榭：全力打造“天下无贼之岛” 005

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基于ABC外排蛋白介导的中药七情配伍的药动学机制研究进展

人民公安报

作者：谢佳单兰兰

宁波市大榭开发区是浙江省第一个财政收入超百亿的开发区，也是我国重要的能源中转基地。近年来，宁波市公安局大榭开发区分局以打造“天下无贼之岛”为切入点，从实际出发，因地制宜构建立体化治安防控体系，以“平安海岛”建设为抓手...

宁波市大榭开发区是浙江省第一个财政收入超百亿的开发区，也是我国重要的能源中转基地。近年来，宁波市公安局大榭开发区分局以打造“天下无贼之岛”为切入点，从实际出发，因地制宜构建立体化治安防控体系，以“平安海岛”建设为抓手，切实履行“保一方平安”的第一责任。

关键词：

来源： cnki报纸评论

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cnki报纸

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中国中药杂志 2018年第4期43卷 676-683页

作者：杨珅珅刘安丽单兰兰曾桐春周倩李遇伯天津中医药大学天津300193 宁夏医科大学药学院宁夏银川750004

ABC外排蛋白是一类依赖ATP水解释放的化学能，介导机体多种内源性和外源性外排蛋白底物的跨膜转运。其广泛存在于人体的各种组织器官中，是人体内重要的功能性膜蛋白。药物改变转运蛋白的表达和（或）功能，将会影响该转运蛋白对应底物... 详细信息

ABC外排蛋白是一类依赖ATP水解释放的化学能，介导机体多种内源性和外源性外排蛋白底物的跨膜转运。其广泛存在于人体的各种组织器官中，是人体内重要的功能性膜蛋白。药物改变转运蛋白的表达和（或）功能，将会影响该转运蛋白对应底物药物的体内处置过程，产生药动学方面的相互作用。外排蛋白主要由P．糖蛋白（P-glyeoprotein，P-gP）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）组成，能够对药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程产生影响。药物对外排蛋白的诱导或抑制作用是中药配伍使用时产生相互作用的重要因素，这种作用可能是七情配伍理论的重要机制之一。该文就七情配伍对ABC外排蛋白的影响进行了简要综述，以揭示外排蛋白在药对配伍中的作用．为中药配伍机制和合理性提供新思路。

关键词： ABC外排蛋白中药配伍抑制诱导