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鸭甲型肝炎病毒反向遗传操作系统的构建

中国动物传染病学报 2024年

作者：硕盾李鲁兆滕巧泱苑纯秀闫大为张志飞潘学许榜丰刘芹防李泽君中国农业科学院上海兽医研究所

鸭病毒性肝炎（DVH）的高发病率和对雏鸭的高致死率已成为制约我国养鸭业发展的一大难题，目前危害最为严重的DVH主要由鸭甲型肝炎病毒（DHAV）引起，DHAV主要有两种基因型，分别为 DHAV-1和DHAV-3，主要攻击4周龄以内雏鸭，引起急性肝... 详细信息

鸭病毒性肝炎（DVH）的高发病率和对雏鸭的高致死率已成为制约我国养鸭业发展的一大难题，目前危害最为严重的DVH主要由鸭甲型肝炎病毒（DHAV）引起，DHAV主要有两种基因型，分别为 DHAV-1和DHAV-3，主要攻击4周龄以内雏鸭，引起急性肝炎和雏鸭死亡。目前主要通过鸡胚连续传代致弱来研制弱毒疫苗，耗时较长。因此，急需一种快速改造DHAV的技术来提高疫苗研究速度。本研究利用RT-PCR方法扩增DHAV-1强毒株（SH8）和DHAV-3强毒株（SH52）的全基因组，将全基因插入pUC19载体构建了重组质粒，以重组质粒为模板、利用融合PCR方法扩增DHAV全基因组，转录为RNA后转染至鸭胚肾（DEK）细胞，最终成功获得两株拯救毒株。将两株拯救毒株在9日龄麻鸭胚连续盲传5代收获病毒，分别命名为r-SH8和r-SH52。将SH8、r-SH8、SH52和r-SH52分别接种9日龄麻鸭胚，发现拯救毒株与野毒株相比，在9日龄麻鸭胚中引起的胚体病变情况相同，病毒滴度相近。本研究成功构建 DHAV-1和DHAV-3反向遗传操作系统，为快速定向突变致弱DHAV奠定了基础。

关键词：鸭甲型肝炎病毒反向遗传病毒拯救

HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性影响

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中国动物传染病学报 2024年

作者：潘晟辉牛世奇王晨阳吕雪华张志飞许榜丰滕巧泱闫大为苑纯秀李泽君刘芹防中国农业科学院上海兽医研究所

为了评价HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性的影响，本研究将HA蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为HA-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/HA的重组火... 详细信息

为了评价HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性的影响，本研究将HA蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为HA-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/HA的重组火鸡疱疹病毒（rHVT-HA和rHVT-HA-2N），通过间接免疫荧光实验鉴定重组病毒中的外源蛋白H9/HA均可以正确表达，Western Blot结果显示经过裂解位点改造后的HA蛋白不发生裂解，说明缺失裂解位点后，HA蛋白不能正常裂解为HA1与HA2蛋白，保持了融合前状态。将重组病毒分别免疫SPF鸡，采集血清进行H9抗体效价的监测，结果显示，针对HA蛋白裂解位点改造过的重组病毒可以在宿主体内诱导免疫应答，但是抗体效价低于带有裂解位点的重组病毒，此结果说明了HA蛋白裂解位点突变明显降低了基于HVT载体的H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性。本研究对H9N2亚型禽流感疫苗设计与免疫效力评估具有参考意义。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA蛋白裂解位点火鸡疱疹病毒

基于CRISPR/Cas9技术的全基因组基因编辑MDCK细胞文库的构建

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中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 17-24页

作者：朱媛媛许榜丰闫鸣昊刘芹防滕巧泱苑纯秀李雪松李泽君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。

关键词： CRISPR/Cas9 MDCK细胞系全基因组基因编辑

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一株传染性支气管炎病毒的分离鉴定及致病性研究

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中国动物传染病学报 2024年

作者：王晨阳牛世奇潘晟辉吕雪华张云翔武子华苑纯秀滕巧泱李泽君刘芹防王彩云内蒙古农业大学兽医学院中国农业科学院上海兽医研究所

传染性支气管炎病毒（IBV）是一种高度传染性的病原体，对家禽造成严重的呼吸道疾病、肾炎综合征和产蛋下降等症状。本研究从江苏省盐城市某养鸡场发病鸡群中，成功分离并鉴定出一株QX型IBV，命名为JSYC2305株。通过RT-PCR检测、病毒分... 详细信息

传染性支气管炎病毒（IBV）是一种高度传染性的病原体，对家禽造成严重的呼吸道疾病、肾炎综合征和产蛋下降等症状。本研究从江苏省盐城市某养鸡场发病鸡群中，成功分离并鉴定出一株QX型IBV，命名为JSYC2305株。通过RT-PCR检测、病毒分离、纯化、鉴定及EID50测定等方法，对病毒的遗传变异和流行病学特征进行了深入研究。结果显示，JSYC2305株具有典型的IBV感染特征，包括在鸡胚上的复制能力和致病性。S1基因的扩增与遗传进化分析表明，JSYC2305株属于QX型IBV，与国内主要流行的基因型相符。此外，研究还评估了JSYC2305株在10日龄鸡胚上的致病性。结果显该毒株在感染的SPF鸡中引起了明显的呼吸道症状和高发病率。通过对感染后鸡只的脏器进行病毒载量检测，发现病毒在多个组织中均有复制，尤其在肺脏和法氏囊中的病毒载量较高。这些结果揭示了JSYC2305株的致病特点和组织嗜性，为IBV的致病机制提供了新的见解。值得注意的是，我们发现JSYC2305株与国内常用疫苗株相似性较低，提示现有疫苗对新型变异株的保护可能不足。本研究为IBV的防治及新型疫苗的研发提供了理论基础，并对家禽养殖业的疾病防控具有重要意义。

关键词：传染性支气管炎病毒分离鉴定 S1基因致病性

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

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中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 39-45页

作者：乔淑媛滕巧泱李雪松刘芹防张志飞王思琪李泽君杨健美王彩云内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究... 详细信息

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒反向遗传技术点突变免疫逃逸

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流感病毒出芽模型与分子机制研究进展

中国动物传染病学报 2018年第3期26卷 1-6页

作者：包旦奇刘芹防中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

流感是对人类健康以及公共卫生安全威胁巨大的一种人畜共患传染病。流感病毒是一种囊膜包被的病毒,以出芽的方式释放病毒粒子。出芽是流感病毒复制周期中十分重要的一个阶段,影响着病毒的传播、致病性以及病毒颗粒外形等。本文主要对目... 详细信息

流感是对人类健康以及公共卫生安全威胁巨大的一种人畜共患传染病。流感病毒是一种囊膜包被的病毒,以出芽的方式释放病毒粒子。出芽是流感病毒复制周期中十分重要的一个阶段,影响着病毒的传播、致病性以及病毒颗粒外形等。本文主要对目前已知的流感病毒出芽模型与相关分子机制进行综述,详细介绍了出芽过程涉及的每种病毒蛋白的功能以及相关领域的最新研究成果,为流感病毒出芽研究提供理论基础。

关键词：流感病毒出芽 HA NA M2

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猪沙门氏菌病病原学、流行病学、诊断及防治进展

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猪业科学 2009年第12期26卷 24-28页

作者：刘芹防崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属成员,具有约2500多种血清型。猪沙门氏菌病又称猪副伤寒(Paratyphoidof pigs),是由沙门氏菌属细菌感染引起的仔猪的一种传染病。急性经过为败血症,慢性者为坏死性肠炎,有时可发生卡他性或干酪性肺炎。在猪... 详细信息

沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属成员,具有约2500多种血清型。猪沙门氏菌病又称猪副伤寒(Paratyphoidof pigs),是由沙门氏菌属细菌感染引起的仔猪的一种传染病。急性经过为败血症,慢性者为坏死性肠炎,有时可发生卡他性或干酪性肺炎。在猪副伤寒的病例中,各国分离的沙门氏菌的血清型也十分复杂,其中主要致病菌为猪霍乱沙门氏菌(*** suis)、猪伤寒沙门氏菌(***-suis)。另外,鼠伤寒沙门氏菌(***)、都伯林沙门氏菌(***)和肠炎沙门氏菌(***)等也常引起本病。沙门氏菌在自然界中十分普遍,是一种条件致病菌,对家养畜禽健康、人类公共安全、食品安全都具有严重的影响。由于沙门氏菌属中的许多血清型对人、各种家畜和家禽以及其它动物有致病性,而猪也可感染多个血清型,除猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌外,很少有其他血清型能引起临床发病,但这些对猪非致病性的血清型可造成猪肉产品的感染。因此,它在公共卫生上具有重要意义。近年来,随着中国养猪业的快速发展,沙门氏菌对养猪业的影响越来越严重。而且沙门氏菌本身就极易产生抗药性,加上生产中抗生素的滥用,导致了沙门氏菌耐药性不断增强,耐药谱扩大,加大了对此病原的预防与治疗的难度。本文就猪沙门氏菌病的最近的研究进展进行了综述,以期为猪沙门氏菌疾病的预防与控制提供新的思路。

关键词：猪沙门氏菌病原学流行病学诊断及防治

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猪RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第12期33卷 953-956页

作者：王晓玲蔺文成刘芹防崔尚金青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立定量检测猪Ⅰ型干扰素信号传导因子mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪Ⅰ型干扰素信号传导因子视黄酸诱导基因-1(RIG-1)、Toll样受体-9(TLR-9)、干扰素调节因子-3(IRF-3)和干扰素调节因子-7(IRF-7)的基因序列设计了特... 详细信息

为建立定量检测猪Ⅰ型干扰素信号传导因子mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪Ⅰ型干扰素信号传导因子视黄酸诱导基因-1(RIG-1)、Toll样受体-9(TLR-9)、干扰素调节因子-3(IRF-3)和干扰素调节因子-7(IRF-7)的基因序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性标准重组质粒,同时选择β-actin作为管家基因,建立了检测猪RIG-1、TLR-9、IRF-3、IRF-7的Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:所建立的检测方法荧光定量PCR扩增均无非特异性产物产生;检测下限均达1.0×101 copies/μL;批内及批间变异系数均小于3%。利用该方法对猪细小病毒(PPV)感染48 h的ST细胞中RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,RIG-1、IRF-3和IRF-7转录水平呈现上调趋势,而TLR-9转录水平呈现下调趋势。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适于猪Ⅰ型干扰素信号传导因子的定量检测分析。

关键词： Ⅰ型干扰素信号传导因子荧光定量PCR 检测

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猪JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2 TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 873-876页

作者：蔺文成王晓玲刘芹防崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立定量检测猪Janus激酶(JAK)和信号转导和转录激活因子(STAT)mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪JAK-1,JAK-2,STAT-1、STAT-2及管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性重组质粒,建立了Taq... 详细信息

为建立定量检测猪Janus激酶(JAK)和信号转导和转录激活因子(STAT)mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪JAK-1,JAK-2,STAT-1、STAT-2及管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性重组质粒,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明:所建立的检测方法荧光定量PCR扩增均无非特异性产物的产生;检测下限均达1.0×101 copies/μL;批内及批间变异系数均小于2%。利用该方法对猪细小病毒(PPV)感染ST细胞48 h后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2 mRNA的转录水平进行了检测,结果表明:JAK-1和JAK-2转录水平显著上调,STAT-1和STAT-2转录水平呈现下调趋势,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适于猪细胞传导因子JAK和STAT的定量检测。

关键词： I型干扰素 JAK-STAT 荧光定量PCR 检测

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