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利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

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中国农业大学学报 2022年第1期27卷 58-66页

作者：赵新刘双刘娜李瑞环曹英芳兰青阔王永天津市农业科学院生物技术研究所天津300384 河北农业大学食品科技学院河北保定071001

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lecti... 详细信息

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。

关键词：拷贝数微滴数字PCR 转基因大豆外源基因

应用微滴数字PCR技术快速检测食用菌中沙门氏菌

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食品与生物技术学报 2017年第3期36卷 315-321页

作者：赵新兰青阔陈锐朱珠刘娜王永天津市农业科学院天津市农业质量标准与检测技术研究所天津300381

定量风险评估是整个风险评估体系的发展趋势和终极体现形式,而快速、准确、简便的定量技术则是保障整个体系顺利、有效完成的核心支撑。作者根据沙门氏菌inv A毒力基因序列,在前人对引物研究结果基础上,合成特异性引物和探针。以沙门氏... 详细信息

定量风险评估是整个风险评估体系的发展趋势和终极体现形式,而快速、准确、简便的定量技术则是保障整个体系顺利、有效完成的核心支撑。作者根据沙门氏菌inv A毒力基因序列,在前人对引物研究结果基础上,合成特异性引物和探针。以沙门氏菌标准菌株为研究对象,建立沙门氏菌微滴数字PCR的快速定量检测方法,并对其特异性、灵敏度、样品实测等关键指标与传统培养法进行对照验证。结果表明,所建立的微滴数字PCR方法具有较好的特异性,检测灵敏度可达到10~2CFU/m L,样品实测与传统国标法对比,二者符合率100%。所建立的沙门氏菌微滴数字PCR定量检测方法,可以快速、准确、直接地分析沙门氏菌的含量,无需构建质粒和标准曲线,避免了因标准曲线量值偏差而影响样品定值的准确性,所建立的方法为食源性沙门氏菌污染的快速定量检测提供了技术支撑,为微生物风险评估体系的完善奠定了基础。

关键词：微滴数字PCR技术沙门氏菌定量检测

胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的InDel分子标记开发与鉴定

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分子植物育种 2023年

作者：王一衡付任胜兰青阔岳东霞杨迎霞陈磊孙海波天津市农业科学院

为利用分子标记辅助选择技术鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育材料，本研究通过对其中一组稳定细胞质雄性不育系及对应保持系的总RNA进行转录组测序分析，与胡萝卜参考线粒体基因组进行比对，筛选出在不育系与保持系之间有差异的InDel位... 详细信息

为利用分子标记辅助选择技术鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育材料，本研究通过对其中一组稳定细胞质雄性不育系及对应保持系的总RNA进行转录组测序分析，与胡萝卜参考线粒体基因组进行比对，筛选出在不育系与保持系之间有差异的InDel位点46个，根据差异位点设计29对引物进行标记筛选。筛选出的特异引物对Mt-14在胡萝卜可育株中扩增得到目的条带为272 bp，在胡萝卜不育株中扩增得到目的条带为264 bp，序列一致性为97.68%。该引物对在4对育成的不育系及其保持系材料和40份常见市售品种中扩增验证，与田间育性鉴定结果一致，准确率为100%，可用于胡萝卜育性鉴定。该分子标记可在苗期准确筛选出胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育材料，提前去除选育过程中的杂株，为胡萝卜制种、繁种等生产工作提供便利。

关键词：胡萝卜细胞质雄性不育 InDel位点分子标记

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丝瓜WRKY基因家族鉴定与表达分析

分子植物育种 2023年

作者：陈珂王成王勃尉万聪兰青阔王莅仝雅娜王俊杰张桂霞王永天津农学院园艺园林学院天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所天津市农业科学院

本研究利用生物信息学技术，在丝瓜基因组中共鉴定出57个LcWRKY基因，命名为LcWRKY1～LcWRKY57，分布在13条scaffolds上。系统进化树表明，LcWRKYs可分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，其中Ⅱ组可进一步分为5个亚组。所有LcWRKYs均具有高度保守的WR... 详细信息

本研究利用生物信息学技术，在丝瓜基因组中共鉴定出57个LcWRKY基因，命名为LcWRKY1～LcWRKY57，分布在13条scaffolds上。系统进化树表明，LcWRKYs可分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，其中Ⅱ组可进一步分为5个亚组。所有LcWRKYs均具有高度保守的WRKYGQK基序及其特有的锌指结构，同一组或亚组的WRKY成员在基因结构和保守基序上表现出一定的相似性。通过启动子顺式作用元件分析，LcWRKYs包含多个与激素、胁迫以及生长发育相关的元件。在低温胁迫下，LcWRKY34表达量上调；高温胁迫下，LcWRKY54持续高表达。本研究从全基因组水平上鉴定和分析了丝瓜WRKY基因家族，为深入研究LcWRKY及温度胁迫下的功能研究提供参考依据。

关键词：丝瓜 WRKY 全基因组鉴定温度胁迫

耐除草剂大豆'DBN9004'精准定量检测方法的建立

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农业生物技术学报 2022年第12期30卷 2446-2455页

作者：赵新刘双刘娜李瑞环高芳瑞兰青阔梁晋刚王永天津市农业科学院农业农村部科技发展中心

耐除草剂大豆(Glycine max)’DBN9004’是我国自主研发的对除草剂草甘膦和草铵膦同时具有耐受性的转基因大豆新品种，已获得安全证书，在中国具有重要的产业化应用前景。为满足转基因作物安全监管技术要求，亟需对其进行定量检测方法的... 详细信息

耐除草剂大豆(Glycine max)’DBN9004’是我国自主研发的对除草剂草甘膦和草铵膦同时具有耐受性的转基因大豆新品种，已获得安全证书，在中国具有重要的产业化应用前景。为满足转基因作物安全监管技术要求，亟需对其进行定量检测方法的研发。本研究以耐除草剂大豆’DBN9004’的3’端旁侧序列为靶标，设计引物和探针，经特异性、正确度、精密度、检出限、定量限等指标测试，建立了该转化体特异性qPCR和微滴数字PCR检测方法。结果显示，本方法特异性强、重复性好，定量限达0.1%(约40个拷贝)，检出限达0.05%(约20个拷贝)，测试样品定值准确度高，相对标准偏差(RSD)为6.00%～10.95%，且qPCR与微滴数字PCR方法定量结果一致。该方法为耐除草剂大豆新品种’DBN9004’的精准定量检测提供了一种新的技术手段，为农业转基因监管提供技术支撑。

关键词：耐除草剂大豆 ’DBN9004’ qPCR 微滴数字PCR 精准定量

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用

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安徽农业科学 2008年第24期36卷 10377-10378,10390页

作者：兰青阔王永赵新朱珠程奕天津市农业科学院中心实验室天津300381

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cp4-epsps合成酶基因(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在65℃保温30 min,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。

关键词：转基因抗草甘膦大豆 cp4-epsps IAMP 检测

抗除草剂大豆GE-J12实时荧光定量PCR检测方法的建立

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生物技术通报 2022年第7期38卷 146-152页

作者：曹英芳赵新刘双李瑞环刘娜徐石勇高芳瑞马卉兰青阔檀建新王永河北农业大学食品科技学院保定071001 天津农业科学院种质资源与生物技术研究所天津300381 安徽省农业科学院水稻研究所合肥230041

GE-J12是中国农业科学院研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草剂大豆新品系。根据抗除草剂大豆GE-J12品系外源基因插入位点5’端转化体特异性序列设计引物和探针,经引物探针筛选、特异性测试、反应体系和程序优化、标准曲线构建、检... 详细信息

GE-J12是中国农业科学院研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草剂大豆新品系。根据抗除草剂大豆GE-J12品系外源基因插入位点5’端转化体特异性序列设计引物和探针,经引物探针筛选、特异性测试、反应体系和程序优化、标准曲线构建、检测极限和定量极限测试等试验,建立了基于TaqMan水解探针的实时荧光定量PCR检测方法。该方法特异性强、准确度高,在RSD小于25%的情况下检测极限为0.032%,定量极限为0.16%,线性度大于0.992,经5%、3%和1%定值样品测试,与真实值平均偏差为2.87%-16.67%。可用于转基因耐除草剂大豆GE-J12转化体特异性序列含量的精准定量,为GE-J12大豆新品系的检测提供了新方法。

关键词：实时荧光定量PCR GE-J12转化体特异性序列

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寿阳旱作区高产、高效用水玉米品种引选研究

作物杂志 2006年第1期 11-13页

作者：兰青阔马兴林陈杰张立军沈阳农业大学生物技术学院辽宁沈阳110161 中国农业科学院作物科学研究所北京中关村南大街12号100081

在寿阳旱作区对引自热量资源相近地区的优良玉米杂交种,以高产和高效用水为目标,进行了品种筛选试验。结果表明:东农250、龙单23和四早113在寿阳旱作区具有很好的适应性,3个杂交种平均产量比寿阳旱作区的主栽品种烟单14高17.1%,比四单19... 详细信息

在寿阳旱作区对引自热量资源相近地区的优良玉米杂交种,以高产和高效用水为目标,进行了品种筛选试验。结果表明:东农250、龙单23和四早113在寿阳旱作区具有很好的适应性,3个杂交种平均产量比寿阳旱作区的主栽品种烟单14高17.1%,比四单19高18.6%,比中单2号高43.5%;水分利用效率比烟单14略高(1.5%),比四单19高12.2%,比中单2号高53.6%,表现出高产、高效用水的显著特点。但寿阳旱作区目前生产中应用的玉米品种粒重较低,已成为产量进一步提高的主要制约因素。因此,今后玉米品种的选择和栽培措施的运筹,重点应放在粒重的提高上。

关键词：寿阳早作区玉米品种产量水分利用效率

应用通用引物量化检测鲜肉及其制品中羊源性成分

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食品研究与开发 2016年第16期37卷 179-184页

作者：赵新刘娜陈锐王成朱珠王永兰青阔天津市农业质量标准与检测技术研究所天津300381

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法... 详细信息

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法,实现科学准确的食品掺假量化判定技术体系。通过特异性、通用性及模拟混合样品的检测,对所建立方法进行验证。结果表明:建立的羊源性成分含量测定方法具有良好的特异性和通用性,且通过标准曲线的构建,呈现良好的线性关系均达0.996以上;通过羊种属特异性基因与16SrDNA内参基因Quantity值及校正系数,可以计算出样品中所含羊源性成份的质量百分比含量,经模拟混合样品的检测,回收率平均值到达96.25%,说明量化研究结果具有较高的准确性。

关键词： 16SrDNA内参基因外源种属特异性基因羊源性成分量化检测