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副结核分枝杆菌PanCD基因缺失株的构建及毒力评价

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黑龙江畜牧兽医 2024年第7期 36-42页

作者：姜艳艳鹿萍崔宁陈凡若崔莹莹党光辉刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室哈尔滨150069

为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium sme... 详细信息

为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明:成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠的肝脏和脾脏中荷菌量显著减少;小鼠肝脏病变明显减轻。说明PanCD基因是MAP的一个重要毒力因子,构建的MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株可作为MAP减毒活疫苗的候选菌株。

关键词：副结核分枝杆菌 PanCD基因基因缺失株毒力评价减毒活疫苗

山羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定及其毒力评价

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黑龙江畜牧兽医 2024年第10期 65-70,114,115页

作者：崔宁党光辉鹿萍郭若男姜艳艳陈凡若刘思国新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室哈尔滨150069

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评... 详细信息

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评价。结果表明:共得到3株分离株,其菌落形态和生化特性菌与伪结核棒状杆菌相符,分别命名为CP045、CP073、CP969;分离株CP045、CP073、CP969的16S rDNA基因序列与伪结核棒状杆菌参考株的相似性分别高达98.8%、100%、99.8%,进一步确定3株分离株均为伪结核棒状杆菌。注射分离株CP073的3只小鼠中有2只于注射后36~48 h陆续死亡,1只精神极度沉郁、食欲不振;注射分离株CP045、CP969的3只小鼠于注射后5 d内均未见死亡,但状态不佳。注射分离株CP045、CP073、CP969的小鼠肝脏均不同程度出血、肿大,脾脏轻微出血;注射分离株CP073的小鼠皮肤表面有黄色脓汁渗出,皮下有黄白色玉米粒大小的结核样脓肿;注射分离株CP045和CP969的小鼠皮下未见明显脓肿。说明该山羊养殖场疑似患有伪结核病的病羊感染了伪结核棒状杆菌,分离到的3株伪结核棒状杆菌毒力不同,其中分离株CP073可引起小鼠死亡,毒力较分离株CP045、CP969强。

关键词：伪结核棒状杆菌伪结核病分离鉴定 16S rDNA 致病性试验生化鉴定

结核分枝杆菌酯酶的表达、纯化、结晶及理化特性研究

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结核分枝杆菌酯酶的表达、纯化、结晶及理化特性研究

作者：党光辉福建农林大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌作为结核传染病的病原微生物,很早就引起了人们的关注,并对其进行过大量的研究。随着耐药结核杆菌突变株的出现,结核杆菌对绝大多数常规治疗药物都出现了不同程度的耐药性,致使结核病在全球范围内呈现回升趋势,我国每年新... 详细信息

结核分枝杆菌作为结核传染病的病原微生物,很早就引起了人们的关注,并对其进行过大量的研究。随着耐药结核杆菌突变株的出现,结核杆菌对绝大多数常规治疗药物都出现了不同程度的耐药性,致使结核病在全球范围内呈现回升趋势,我国每年新发肺结核病人145万人,结核病已成为我国传染性疾病中的第一号杀手。通过研究发现,结核分枝杆菌的致病性和耐受性都与其较高的酯类物质含量密切相关。而酯类的代谢主要由酯酶进行调控。所以研究此酯酶的结构和功能有助于更好了解结核分枝杆菌在致病中的作用,并针对性的研发新一代的结核病治疗药物。本文研究的酯酶基因(Esterase) rv3036c来源于结核分枝杆菌H37Rv,是其酯酶中的一种,。由于结构等相关数据的缺乏,使得对于Rv3036c在结核分枝杆菌酯代谢中的作用与功能尚不清楚。本研究工作主要包括rv3036c基因重组载体构建、Rv3036c蛋白的表达纯化、蛋白结晶以及理化特性研究。rv3036c基因重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导重组Rv3036c蛋白的大量表达,经过Ni-NTA亲和层析、DEAE离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析等纯化技术,得到99%以上纯度的目的蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量为25.5KD。应用分光光度法验证了其具有酯酶活性。采用气相扩散悬滴法对Rv3036c的结晶条件进行了筛选与优化,最终在一个结晶条件下获得了适合X-射线衍射的单晶。本研究建立了酯酶表达纯化、蛋白结晶及酯酶测定的有效方法,从而为下一步抗结核分枝杆菌药物设计与开发提供参考依据,具有重要的理论价值和实际应用前景。

关键词：结核分枝杆菌酯酶 Rv3036c 蛋白质结晶 X射线衍射理化特性研究

结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 502-509页

作者：陈凡若党光辉张嘉俊鹿萍崔宁崔莹莹崔子寅刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p... 详细信息

结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms,经western blot鉴定结果显示,p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分,经western blot鉴定结果显示,r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定,结果显示,p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙,脊不规则且相对较高,褶皱不明显;p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞,通过q RT-PCR检测pe26转录水平,结果显示,H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞,分别通过q RT-PCR、ELISA检测细胞因子转录和表达水平,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、流式细胞术和胞内定殖的方法检测细胞毒性,结果显示,p AIN-PE26/Ms促进宿主细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的转录和表达(P<0.05);r PE26促进巨噬细胞死亡,且在感染48 h时促进细胞早期凋亡(P<0.05);r PE26促进p AIN-PE26/Ms在巨噬细胞内的定殖(P<0.01)。上述结果首次表明,定位于细胞壁的r PE26在感染巨噬细胞过程中促进p AIN-PE26/Ms的生长、炎性细胞因子的转录和表达、巨噬细胞凋亡和胞内定殖。本实验为解析PE26参与分枝杆菌的致病机制和MTB调节宿主免疫反应的机制提供一定参考依据。

关键词：结核分枝杆菌巨噬细胞 PE/PPE家族蛋白 PE26

结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结晶及其对分枝杆菌致病性的影响

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黑龙江畜牧兽医 2022年第11期 16-20,25,134页

作者：唐阳阳李华芳邵明珠藏鑫鑫崔子寅陈利苹党光辉刘思国吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队哈尔滨150069

为了研究结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结构、黏附途径及其在分枝杆菌致病过程中的作用,试验通过亲和层析法纯化Rv0394c蛋白,然后使用蛋白结晶筛选试剂盒筛选蛋白质结晶条件,通过亚细胞定位确定Rv0394c蛋白在分枝杆菌中的定位;通过激... 详细信息

为了研究结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结构、黏附途径及其在分枝杆菌致病过程中的作用,试验通过亲和层析法纯化Rv0394c蛋白,然后使用蛋白结晶筛选试剂盒筛选蛋白质结晶条件,通过亚细胞定位确定Rv0394c蛋白在分枝杆菌中的定位;通过激光共聚焦显微镜观察Rv0394c蛋白与A549细胞的黏附情况;随后进行重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)与A549细胞的黏附和黏附阻断试验并计数肺脏荷菌数;用重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)滴鼻感染小鼠,在不同感染时间分别摘取肺脏观察病理变化并进行荷菌数计数。结果表明:成功获得Rv0394c蛋白。Rv0394c蛋白浓度为8 mg/mL时,在0.15 mol/L二水氯化钙-0.1 mol/L三水醋酸钠-pH值为4.6-15%异丙醇条件下,Rv0394c蛋白出现单晶生长。Rv0394c蛋白为胞外蛋白且能通过透明质酸(HA)黏附于A549细胞表面;与pMV262_Ms相比,Rv0394c_Ms黏附于A549细胞的数量极显著增加(P<0.01),用Rv0394c蛋白、HA和兔抗Rv0394c多克隆抗体处理的Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数(P<0.01)。在感染小鼠第4,8,14天,Rv0394c_Ms组在肺脏中的荷菌数极显著高于pMV262_Ms组(P<0.01);在第8天,Rv0394c_Ms组荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms+HA组(P<0.01)。Rv0394c蛋白能诱导小鼠肺脏的病理损伤。说明黏附蛋白Rv0394c是通过透明质酸黏附于肺脏上皮细胞参与分枝杆菌致病过程的。

关键词：分枝杆菌黏附蛋白 Rv03914c 结晶致病性细胞黏附

结核分枝杆菌转录调控蛋白Rv0827c(KmtR)调控靶点的初步研究

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中国预防兽医学报 2022年第8期44卷 823-830页

作者：王慧崔莹莹唐祎依吕明月党光辉崔子寅曹俊宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 潍坊医学院生命科学与技术学院山东潍坊261053

结核分枝杆菌(MTB)通过转录调控系统快速适应宿主的防御系统与环境变化,从而形成持续感染,但其机制不明。为研究转录调控蛋白Rv0827c与通过细菌单杂交预测的23种基因的启动子DNA在体内与体外条件下的结合情况,明确Rv0827c与已确定基因rv... 详细信息

结核分枝杆菌(MTB)通过转录调控系统快速适应宿主的防御系统与环境变化,从而形成持续感染,但其机制不明。为研究转录调控蛋白Rv0827c与通过细菌单杂交预测的23种基因的启动子DNA在体内与体外条件下的结合情况,明确Rv0827c与已确定基因rv3616c启动子结合的影响因素,本研究利用PCR从MTB H37Ra株基因组DNA中扩增rv0827c基因后构建重组质粒pET-22b-rv0827c,经IPTG诱导表达和纯化后获得重组蛋白Rv0827c(rRv0827c),同时以MTB H37Ra株基因组为模板扩增23种基因的启动子。通过体外凝胶迁移试验(EMSA)和体内染色质免疫共沉淀试验(ChIP)对rRv0827c与这23种基因启动子的相互作用及其互作区域进行检测,结果显示,rRv0827c与23种启动子DNA均能结合,且rRv0827c能够特异性地结合rv3616c(espA)启动子DNA,并结合于其大沟区域;通过EMSA对影响rRv0827c和rv3616c启动子DNA结合的金属离子进行筛选显示,Ni^(2+)、Co^(2+)在体外抑制rRv0827c与rv3616c启动子的结合,而Cr^(3+)则促进二者的结合;表面等离子共振试验(SPR)也进一步验证rRv0827c能够特异性地结合rv3616c(espA)启动子DNA;利用MEME软件分析23种启动子DNA核苷酸序列的保守性,结果显示,4G和10G为rv3616c启动子DNA与rRv0827c互作的关键核苷酸位点。本研究首次揭示了rRv0827c与多基因启动子DNA结合的广泛性,且直接调控rv3616c的表达,进而可能影响MTB的毒力。这对完善Rv0827c的调控网络及深入解析Rv0827c的调控功能奠定了理论基础。

关键词：结核分枝杆菌转录调控蛋白Rv0827c rv3616c

固原市原州区微灌工程系统选择及管网布置研究

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种子科技 2016年第11期34卷 92-92,94页

作者：党光辉固原市原州区水务局宁夏固原756000

加强农业高效节水工作,是缓解宁夏干旱缺水矛盾、推动农业种植结构调整和耕作技术变革的重要举措,是促进传统农业向高效集约现代农业转变的根本措施,也是落实最严格水资源管理制度、全面提高农业用水效率、强化水资源合理利用的重要措... 详细信息

加强农业高效节水工作,是缓解宁夏干旱缺水矛盾、推动农业种植结构调整和耕作技术变革的重要举措,是促进传统农业向高效集约现代农业转变的根本措施,也是落实最严格水资源管理制度、全面提高农业用水效率、强化水资源合理利用的重要措施。介绍了原州区农业节水所采用微灌工程的系统选择及管网布置情况。

关键词：微灌工程系统选择管网布置

结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2023年第1期45卷 51-59页

作者：蔡珠明党光辉臧鑫鑫邵明珠唐阳阳鹿萍崔莹莹崔子寅刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(M... 详细信息

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

关键词：结核分枝杆菌复合群副结核分枝杆菌禽分枝杆菌禽亚种多重Taq Man荧光定量PCR

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浅谈太钢AOD炉智能炼钢系统

太钢科技 2009年第1期 61-64页

作者：郝娜党光辉太钢自动化公司太钢三钢厂

本文主要论述了太钢的AOD智能炼钢系统，系统的主要功能模块及各模块的作用，介绍了该系统的软硬件配置以及网络结构。通过对智能炼钢系统的介绍，也展示了大型现代化炼钢厂在使用了先进的技术、装备后，所带来的显著的经济效果。

关键词： AOD炉智能炼钢技术模型