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多聚酶链反应诊断生殖支原体感染的研究

中华传染病杂志 1999年第4期17卷 259-260页

作者：常哲吴移谋余敏君肖建华张艳湖南省衡阳医学院 421001

生殖支原体(Mg)与急、慢性非淋菌性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、宫颈炎或盆腔炎、不育症等疾病[1]有关.Mg的生长极其缓慢,初代生长时间长,需要的营养成分复杂,从临床标本中分离培养Mg难度大,阳性率很低.血清学诊断因与肺炎支原体(Mp)有... 详细信息

生殖支原体(Mg)与急、慢性非淋菌性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、宫颈炎或盆腔炎、不育症等疾病[1]有关.Mg的生长极其缓慢,初代生长时间长,需要的营养成分复杂,从临床标本中分离培养Mg难度大,阳性率很低.血清学诊断因与肺炎支原体(Mp)有交叉反应而特异性差.为评价聚合酶链反应(PCR)方法检测Mg的可靠性,了解Mg在衡阳地区高危人群中的感染状况,我们在MgPa基因上选择了3对不同的引物,用PCR方法对泌尿生殖道感染患者的标本进行了Mg检测,现将结果报告如下.

关键词：支原体感染生殖系统感染聚合酶链反应诊断

Study of isolation of fluoroquinolone-resistant Ureaplasma urealyticum and identification of mutant sites

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Chinese Medical Journal 2002年第10期115卷 133-135,157页

作者：张文波吴移谋尹卫国余敏君南华大学基础医学院微生物学教研室湖南衡阳421001

To study the resistance mechanism of clinical isolates of Ureaplasma urealyticum resistant to fluoroquinolones Methods Thirteen isolates of Ureaplasma urealyticum resistant to six fluoroquinolones were selected out of 184 clinical isolates and their QRDRs (quinolone resistance determining region) gyrA, gyrB, parC and parE were amplified by PCR Sequencing results were compared to those susceptible reference strains and a comparison of deduced amino acid sequences were performed Results Sequence comparison revealed a C to A change at 87nt of gyrA QRDR leading to the substitution of Asp95 with glutamic acid and a C to T change at 50nt of parC QRDR leading to the substitution of Ser80 with leucine Conclusion These results suggest that a C to A change at 87nt of gyrA QRDR and a C to T change at 50nt of parC QRDR are associated with fluoroquinolone resistance of Ureaplasma urealyticum

关键词： Ureaplasma urealyticum · genes structural · mutation · drug resistance microbial · fluoroquinolone

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穿透支原体P35蛋白对细胞因子的诱生作用

中华微生物学和免疫学杂志 2004年第9期24卷 707-710页

作者：朱翠明吴移谋万艳平余敏君南华大学微生物学与免疫学教研室衡阳421001

目的　构建pQE31/p35原核细胞表达载体 ,研究穿透支原体 (Mpe)相对分子质量 (Mr)为 35× 10 3 蛋白 (P35 )诱生巨噬细胞 (MΦ)分泌TNF α、IL 1β、IL 6等细胞因子 (CKs)的作用。方法　PCR扩增p35全长 10 0 2bp基因片段 ,克隆至pQE31原... 详细信息

目的　构建pQE31/p35原核细胞表达载体 ,研究穿透支原体 (Mpe)相对分子质量 (Mr)为 35× 10 3 蛋白 (P35 )诱生巨噬细胞 (MΦ)分泌TNF α、IL 1β、IL 6等细胞因子 (CKs)的作用。方法　PCR扩增p35全长 10 0 2bp基因片段 ,克隆至pQE31原核细胞表达载体 ,用PCR介导的突变将p35基因中两个“TGA”终止密码子定点突变为“TGG” ,使其在大肠杆菌 (E .coli)中编码表达色氨酸。IPTG诱导pQE31/p35在E .coli中表达目的蛋白rP35 ,用Ni NTASpin亲和纯化 ,Westernblot鉴定表达产物。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测P35刺激小鼠MΦ分泌TNF α、IL 1β和IL 6的量。结果　PCR扩增出约 1kb的DNA片段 ,克隆至pQE31载体 ,筛选到阳性克隆pQE31/p35 ,p35基因中两个“TGA”终止密码子成功突变成“TGG”。IPTG诱导pQE31/p35在E .coli中表达出Mr 约 37× 10 3 的蛋白质 ,Westernblot鉴定其为rP35。ELISA结果表明 ,P35能刺激小鼠MΦ分泌大量的TNF α、IL 1β和IL 6。结论　P35能诱导MΦ分泌TNF α、IL 1β、IL

关键词： IL-6 TNF-α 细胞因子 IL-1β 分泌支原体蛋白 IPTG 密码子表达载体

幽门螺杆菌VacA N端在巨噬细胞中表达对其细胞因子分泌功能的影响

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微生物学报 2008年第3期48卷 349-354页

作者：黎村艳张艳刘志杰余敏君于文湖南省南华大学病原生物学研究所衡阳421001

构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响。PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞... 详细信息

构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响。PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,Western blot和荧光显微镜鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄入法观察巨噬细胞的空泡样变;ELISA法检测巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β含量。重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h,部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡,且重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)下调细胞因子的分泌。结果显示,成功构建pDsRed-Monomer-C1/vacA真核表达载体;VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β;核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌。

关键词：幽门螺杆菌空泡毒素真核表达载体巨噬细胞细胞因子

沙眼衣原体主要外膜蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

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中华皮肤科杂志 2004年第12期37卷 709-711页

作者：李忠玉吴移谋陈超群余敏君南华大学医学院微生物学教研室湖南省衡阳市421001

目的克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建原核表达重组载体,并通过***21实现MOMP的融合表达。方法用PCR法扩增MOMP基因,克隆插入到pUCm-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,采用Ni-NTA亲和层析法纯化... 详细信息

目的克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建原核表达重组载体,并通过***21实现MOMP的融合表达。方法用PCR法扩增MOMP基因,克隆插入到pUCm-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,采用Ni-NTA亲和层析法纯化表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定。结果PCR扩增出约1200bpDNA片段,序列测定证实与基因库登陆的D型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为47000,与预期分子质量相符,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白。结论沙眼衣原体MOMP基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为沙眼衣原体核酸疫苗的研究奠定了基础。

关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白表达产物大肠杆菌基因序列测定特异性蛋白 T载体亚克隆蛋白质印迹

Activation of nuclear factor κB and induction of inducible nitric oxide synthase by lipid-associated membrane proteins isolated from Mycoplasma penetrans

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Chinese Medical Journal 2004年第7期117卷 997-1001页

作者：曾焱华吴移谋张文波余敏君朱翠明谭立志 Department of Microbiology

Background This study was designed to investigate the potential pathogenicity of Mycoplasma penetrans (M. penetrans) and its molecular mechanisms responsible for the induction of iNOS gene expression in mouse macrophages stimulated by lipid-associated membrane proteins (LAMPs) prepared from M. *** Mouse macrophages were stimulated with M. penetrans LAMPs to assay the production of nitric oxide (NO). The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was detected by RT-PCR and Western blotting. The activity of nuclear factor κB (NF-κB) and the effects of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an inhibitor of NF-κB, on the production of nitric oxide and the expression of iNOS were also assessed in mouse macrophages treated with M. penetrans LAMPs by indirect immunofluorescence and Western *** M. penetrans LAMPs stimulated mouse macrophages to produce nitric oxide in a dose- and time-dependent manner. The mRNA and protein levels of iNOS were also upregulated in response to LAMP stimulation and inhibited by PDTC treatment. M. penetrans LAMPs were found to trigger NF-κB activation, a possible mechanism for the induction of iNOS *** This study demonstrated that M. penetrans may be an important etiological factor of certain diseases due to the ability of M. penetrans LAMPs to stimulate the expression of iNOS, which is probably mediated through the activation of NF-κB.

关键词： mycoplasma penetrans nuclear factor kappa B nitric oxide synthase membrane proteins

壳聚糖介导增强幽门螺杆菌Lpp20 DNA疫苗黏膜免疫效果的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第2期31卷 140-145页

作者：曹斌张艳刘志杰于文余敏君南华大学病原生物研究所衡阳421001

目的探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖（CS）纳米粒（NPs）,并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫（滴鼻和口服）小鼠,检测免疫小鼠的细胞和... 详细信息

目的探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖（CS）纳米粒（NPs）,并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫（滴鼻和口服）小鼠,检测免疫小鼠的细胞和体液免疫水平.结果裸质粒pcDNA3.1（＋）/Lpp20与CS/DNA NPs通过黏膜免疫均能诱导小鼠产生有效的免疫应答.CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组诱导的抗体明显升高,与裸质粒组相比有明显差异（P＜0.05）,同时CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数及培养上清中IFN-γ和IL-4含量明显高于裸质粒组、壳聚糖组和PBS组,且滴鼻免疫组高于口服组.结论壳聚糖纳米粒能增强pcDNA3.1（＋）/Lpp20核酸疫苗的黏膜免疫（滴鼻和口服免疫）效果载Lpp20基因壳聚糖纳米粒滴鼻免疫比口服免疫能诱导更强的细胞和体液免疫应答.

关键词：壳聚糖纳米粒幽门螺杆菌 Lpp20 核酸疫苗免疫原性

解脲支原体药敏与tetM基因检测及生物群的研究

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中国皮肤性病学杂志 2001年第1期15卷 4-6,34页

作者：张艳吴移谋余敏君尹卫国衡阳医学院微生物教研室湖南衡阳421001

目的　了解泌尿生殖道支原体的耐药性机理 ,指导临床治疗。方法　采用微量肉汤稀释法测定 2 81株UU对 5种抗菌药物的最低抑菌浓度 (MIC) ,用PCR法扩增tetM基因并酶切 ,用UUMB抗原基因引物对tetM基因阳性UU株进行生物群的研究。结果　 2... 详细信息

目的　了解泌尿生殖道支原体的耐药性机理 ,指导临床治疗。方法　采用微量肉汤稀释法测定 2 81株UU对 5种抗菌药物的最低抑菌浓度 (MIC) ,用PCR法扩增tetM基因并酶切 ,用UUMB抗原基因引物对tetM基因阳性UU株进行生物群的研究。结果　 2 81株UU中 82株对四环素MIC为 16～ 2 5 6μg/ml ,3 9株为 8μg/ml ,7株为 4μg/ml,15 3 株MIC <4μg/ml;12 1株MIC≥ 8μg/ml及 2株MIC =4μg/ml者均出现 3 77bptetM基因阳性带 ;阳性检测率为 43 .77%。15 8株UUMIC≤ 4μg/ml未见类似扩增带。扩增产物用HpaⅡ酶切和电泳分析 ,均产生 2 79bp和 98bp两个特异性片段。2 81株UU用群特异性PCR分析 ,生物群 1有 166株 ,生物群 2有 115株 ;12 3株tetM阳性UU株 ,属生物群 1、2者分别有 5 4株和 69株 ,分别占 3 2 .5 3 % ( 5 4/166)和 60 .0 % ( 69/115 ) ( χ2 =7.94,P <0 .0 5 )。结论　①PCR技术检测泌尿生殖道感染患者UU耐药性tetM基因具有特异、敏感、快速等优点 ;②载有tetM基因的UU株可能成为四环素耐药株 ,应进行监测及随访 ;③我国衡阳地区UU四环素耐药株以生物群 2占优势。

关键词：解脲支原体聚合酶链反应 tetM基因生物群非淋菌性尿道炎

幽门螺杆菌VacA通过激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌及凋亡

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第5期29卷 454-459页

作者：黎村艳张艳余敏君刘志杰于文南华大学病原生物学研究所衡阳421001

目的研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）空泡毒素（VacA）单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞分泌和凋亡的影响，以及核因子κB（nuclear factor κB，NF—κB）在调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞功能中的作用。方法将pDsRed—Monomer—C1... 详细信息

目的研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）空泡毒素（VacA）单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞分泌和凋亡的影响，以及核因子κB（nuclear factor κB，NF—κB）在调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞功能中的作用。方法将pDsRed—Monomer—C1／vacA转染THP-1巨噬细胞，ELISA法检测巨噬细胞培养上清IL-1β、TNF-α含量；Griess试剂分析培养上清的一氧化氮（NO）水平；荧光探针DCFH-DA检测培养上清的活性氧（ROS）；流式细胞仪检测细胞的凋亡率；凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility gel shift assay，EMSA）检测NF—κB的核转位。结果重组质粒转染后6h，重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于阴性对照组（P〈0．05）；且分别于转染后6h或24h到达峰值；转染后6h或12b，重组质粒组培养上清中NO、ROS含量明显高于阴性对照组（P〈0．05），且于转染后24h达到高峰。转染后16h，重组质粒组的凋亡率明显升高，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。重组质粒组加NF—κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）后，IL-1β、TNF-α、NO、ROS的分泌量和细胞的凋亡率明显降低，与重组质粒组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。EMSA试验显示，转染后3h细胞核内有活化的NF—κB，且于转染后12h活性最强。结论VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO和ROS；VacA蛋白瞬时高表达诱导THP-1巨噬细胞凋亡；NF—κB可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌和凋亡。

关键词：幽门螺杆菌空泡毒素巨噬细胞凋亡 NF-κB

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