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P450的定向进化及在尼龙12单体生物合成中的应用

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P450的定向进化及在尼龙12单体生物合成中的应用

作者：余嘉铭浙江大学

学位级别：硕士

尼龙12(Nylon 12,PA12)作为一种重要的工程塑料,其低密度、低吸水性、耐高温、耐腐蚀等诸多优异的性能促进了在汽车、电子电器、管道线缆、3D打印和生活用品等多个领域的应用。然而,目前依赖于化学合成的PA12工业生产存在诸如使用有毒... 详细信息

尼龙12(Nylon 12,PA12)作为一种重要的工程塑料,其低密度、低吸水性、耐高温、耐腐蚀等诸多优异的性能促进了在汽车、电子电器、管道线缆、3D打印和生活用品等多个领域的应用。然而,目前依赖于化学合成的PA12工业生产存在诸如使用有毒有害原料、环境压力大、废弃物处置难、工艺流程复杂及操作难度高等问题。相比之下,作为一种更温和、绿色的替代方法,从可再生原料出发通过一系列酶促反应合成PA12单体的生物合成路线受到广泛的关注。受限于系列酶促反应中的关键酶限速步骤以及生物工厂的稳定性,目前PA12单体的生物合成产量仍然较低。为了提高PA12单体的生物合成效率,本文以大肠杆菌为操作平台,开展了关键酶定向进化、多酶平衡表达、代谢途径优化和耐受性强化等一系列研究工作。首先,作为PA12单体生物合成的重要原料之一,月桂酸(Lauric acid,DDA)的末端羟基化效率决定了目标产物的产量。为了提高催化这一步骤的关键酶P450的催化活性,建立了定向进化所需的高通量筛选方法,该方法由前人报道的用于筛选脂肪酸末端羟基化活性P450突变体的ABTS比色法优化而得,能够避免假阳性的出现并提高检测的准确性。将优化后的ABTS 2.0比色法用于cyp153a-ncpG307A的定向进化,并成功从两轮定向进化共2000个克隆中获得了高酶活突变体M3(cyp153a-ncpG307A/R14R/D629G),其对DDA的ω-羟基化活性提高了 90.3%,在4 h内可催化产生2.78±0.08 g/L 12-羟基月桂酸(12-Hydroxylauric acid,ω-OHDDA),产率为 85.8%。其中,N端同义突变R14R改善了 P450的可溶性表达,而D629G突变缩短了FMN和FAD之间的电子转移距离,由此产生的突变体对其它相似底物也有酶活性改善的效果。将此突变体应用于PA12单体12-氨基月桂酸(12-Aminododecanoic acid,ω-AmDDA)的生物合成,并将原有的醇脱氢酶BsADH替换成*** GPo1来源的醇脱氢酶AlkJ以及利用核糖体结合位点(Ribosome-binding site,RBS)工程平衡了各酶的表达,从而避免了中间产物ω-OHDDA的积累,以DDA为底物,所构建的P1-1(E-M3-3/C-rbs3-alkJ)菌株产生了 1.72±0.04 g/L ω-AmDDA(产率为 79.8%)。随后,通过适度上调大肠杆菌血红素合成相关基因hemB,并敲除血红素降解相关基因yfeX,实现了大肠杆菌血红素合成的增强,为P450的羟基化活性提供充足的血红素,进而促进了活性P450的表达。该策略在ω-AmDDA的生物合成途径中的应用,进一步提高了ω-AmDDA的合成效率。以DDA为底物,所构建的B3-2菌株将ω-AmDDA的产量提升至2.02±0.03 g/L(产率为93.6%)。最后,将P450突变体和血红素合成增强策略应用于PA12单体ω-AmDDA的从头生物合成,构建的PDANR-B-3菌株经20 h摇瓶培养后可产生593.6±32.8 mg/L ω-AmDDA。本研究建立的高通量筛选方法、在P450还原酶结构域中鉴定的热突变位点以及用于增加血红素供应的策略将为工程设计其他涉及P450的生物过程提供有益的借鉴。同时,本研究中构建的以DDA或葡萄糖为可再生原料合成ω-AmDDA的大肠杆菌工程菌株为PA12的生物法合成奠定了基础。

关键词：尼龙12 月桂酸生物合成 P450 定向进化血红素合成代谢工程

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FVB—K抗结露袋除尘器在烘干机上的应用

水泥．石灰 1993年第5期 34-35,40页

作者：余嘉铭

基于四大MOOC平台艺术类开课高校的区域研究

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读与写(教育教学刊) 2019年第2期 36-37页

作者：余嘉铭王远深圳大学

本研究基于中国四大MOOC平台的数据,分析高校艺术类课程开课情况的区域差异,得出开设课程高校地区间的分布不均衡,呈现出东多西少,北多南少的一种结论。华东地区开课高校及课程最多,各地区间的差异非常明显。经研究,主要是因为历史因素... 详细信息

本研究基于中国四大MOOC平台的数据,分析高校艺术类课程开课情况的区域差异,得出开设课程高校地区间的分布不均衡,呈现出东多西少,北多南少的一种结论。华东地区开课高校及课程最多,各地区间的差异非常明显。经研究,主要是因为历史因素、经济发展、主观意识三个因素影响着地区间的差异。

关键词：四大MOOC平台艺术类课程开课高校区域分布开课数量

利用因特网为专业期刊服务——“水泥工程网站”的开发应用经验

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科技与出版 2001年第3期 39-41页

作者：余嘉铭沈新水泥工程杂志社

1 专业期刊与因特网结合的必要性和可能性众所周知，专业期刊是以纸张为载体，用一定的版面、页码和出版周期，为某一行业中特定的读者群体提供信息交流（或发布）的媒体。杂志社（或编辑部，下同）通过这个媒体向读者传播政策导向、... 详细信息

1 专业期刊与因特网结合的必要性和可能性众所周知，专业期刊是以纸张为载体，用一定的版面、页码和出版周期，为某一行业中特定的读者群体提供信息交流（或发布）的媒体。杂志社（或编辑部，下同）通过这个媒体向读者传播政策导向、新技术、新产品、实践经验等各种信息；读（作）者通过这个媒体获取（或发布）其所需要的各种信息，双方相辅相成。从这个意义上说，杂志社是信息传播过程中的“中间商”。采用何种手段（或技术）采集、编辑各种信息，择其精要予以发表并加快信息流速，是我们在信息中介服务中必须认真对待的问题。

关键词：因特网专业期刊信息交流杂志社网站建设专业网站

加入WTO对我国水泥工业的影响——访华新水泥股份有限公司董事长李叶青先生

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水泥工程 2002年第1期 1-6页

作者：徐凤娟余嘉铭本刊记者

2001年12月11日,在我国经济发展史上是一个载入史册的日子———中国正式加入WTO。欢欣之余,政府、企业以及我们每个人都在思考:我们将会有怎样的机遇,将会面对怎样的挑战?对水泥工业而言,入世究竟对我国的水泥企业、水泥市场、水泥产... 详细信息

2001年12月11日,在我国经济发展史上是一个载入史册的日子———中国正式加入WTO。欢欣之余,政府、企业以及我们每个人都在思考:我们将会有怎样的机遇,将会面对怎样的挑战?对水泥工业而言,入世究竟对我国的水泥企业、水泥市场、水泥产业结构调整将有什么影响?带着这些问题,我们采访了由老牌大型国有企业转型并具外资背景的上市公众公司———华新水泥股份有限公司的董事长李叶青先生(以下简称李董事长)。我们希望,本篇采访稿能给广大读者带来一些信息和一些思考。本文各级标题为本刊记者(以下简称“记”)整理采访文稿时另加。

关键词：水泥外资外国资本建筑材料工业水泥工业水泥企业董事长华新水泥股份有限公司 WTO 李叶先生

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新型链式输送机及其在水泥厂的应用

水泥．石灰 1993年第5期 36-40页

作者：李大清余嘉铭

关注中材国际——访中材国际工程股份有限公司总裁王伟先生

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水泥工程 2002年第2期 1-5页

作者：徐凤娟余嘉铭

2001年12月29日中材国际工程股份有限公司（以下简称“中材国际”）挂牌成立,也许是巧合,在同月的18天前中国加入WTO,2天后新世纪的元年成为历史,选择这样一个挂牌日,给我们留下了丰富的想象空间。那么对我国建材工程服务领域会产生怎... 详细信息

2001年12月29日中材国际工程股份有限公司（以下简称“中材国际”）挂牌成立,也许是巧合,在同月的18天前中国加入WTO,2天后新世纪的元年成为历史,选择这样一个挂牌日,给我们留下了丰富的想象空间。那么对我国建材工程服务领域会产生怎样的影响呢?我们相信,这样一个目前我国建材工程服务领域综合实力和比较优势最强的企业组建,肯定会对我国建材工程服务市场产生影响,对国内同行的改革亦有示范作用。为此,我们采访了执掌帅旗的“中材国际”总裁王伟先生（以下简称“王总”）,试图通过我们的采访,来了解一点“中材国际”的走向及发展路线。本文各级标题为本刊记者（以下简称“记”）整理文稿时另加。

关键词：人物专访中材国际工程股份有限公司王伟

经皮冠状动脉支架植入术后老年患者疾病不确定感影响因素及护理对策

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老年医学与保健 2022年第6期28卷 1272-1277页

作者：夏碧芸余嘉铭吴霄芸复旦大学附属华东医院心内科上海200040

目的探讨经皮冠状动脉支架植入术后老年患者疾病不确定感影响因素及护理对策。方法采用便利抽样法,选取2021年1月—6月在复旦大学附属华东医院心血管内科行经皮冠状动脉支架植入术的老年患者168例,采用《中文版疾病不确定感量表(MUIS)... 详细信息

目的探讨经皮冠状动脉支架植入术后老年患者疾病不确定感影响因素及护理对策。方法采用便利抽样法,选取2021年1月—6月在复旦大学附属华东医院心血管内科行经皮冠状动脉支架植入术的老年患者168例,采用《中文版疾病不确定感量表(MUIS)》评估患者疾病不确定感影响因素。结果文化程度、是否退休、与子女同住、支架植入数、住院期间护士指导与支持、子女/配偶给予照顾与支持、自觉症状改善程度、心绞痛发作频率、出院后有随访护士的支持等因素差异均有统计学意义(P<0.05)。结论经皮冠状动脉支架植入术后老年患者均存在中高水平的不确定感影响因素,为制定针对性、个体化和综合性的临床护理干预提供依据。

关键词：老年经皮冠状动脉支架植入术疾病不确定感影响因素

三狮是怎样发力的——访浙江三狮集团董事长、总经理姚季鑫先生

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水泥工程 2002年第4期 1-4页

作者：余嘉铭徐凤娟方跃卜志一不详《浙江水泥》

浙江三狮集团（以下简称:“三狮”）是一家老牌省属国企,多年来一直是浙江水泥行业的龙头骨干企业,在浙江水泥界举足轻重。但自20世纪80年代新型干法水泥生产技术在我国问世以来,三狮一直蛰伏未动,维持着湿法生产方式,这一点让人费解。... 详细信息

浙江三狮集团（以下简称:“三狮”）是一家老牌省属国企,多年来一直是浙江水泥行业的龙头骨干企业,在浙江水泥界举足轻重。但自20世纪80年代新型干法水泥生产技术在我国问世以来,三狮一直蛰伏未动,维持着湿法生产方式,这一点让人费解。近2年来,随着产业结构调整,浙江省强制关闭了200多家小水泥企业,腾出了约1000多万t的水泥市场空间。为此,浙江省大量民间资本进入水泥行业,有一大批1000t/d以上的新型干法生产线已建、在建或拟建。不久前,三狮水泥股份公司 2500t/d新型干法生产线、浙江红狮水泥股份有限公司 2000t/d新型干法生产线也相继点火投产。从而结束了浙江省虽水泥总产居全国第四,但多年来一直维系着以湿法窑或小立窑生产为主的产业结构现状,也结束了无2000t/d以上新型干法生产线的尴尬历史。现在,浙江省的水泥生产技术优化和产业结构升级调整,今行业人士惊喜。我们看到,浙江水泥界起跑了。在我国加入WTO（国有企业原享受的一些政策将不复存在）、国际资本、国内民间资本进入水泥行业（浙江省尤其如此）这一历史背景下,水泥市场将被重新划分。作为曾是浙江省龙头企业的三狮将如何调整、改革,重新坐回龙头位置,为我们及我们的读者所关注的。听说三狮已筹措了十几亿的资金。

关键词：国企改革产业结构水泥企业浙江三狮集团姚季鑫