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FMDV P1基因转化玉米和HIV-1 gag与gp120基因转化番茄的研究

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FMDV P1基因转化玉米和HIV-1 gag与gp120基因转化番茄的研究

作者：余云舟中国人民解放军军需大学

学位级别：硕士

本研究分别将编码口蹄疫病毒(Foot and Mouth disease Virse，FMDV)的结构蛋白P1全长基因，人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV-1)的结构蛋白gag基因、外膜糖蛋白gp120基因及gag-gp120嵌合基因克隆到含CaMV35S启动子控... 详细信息

本研究分别将编码口蹄疫病毒(Foot and Mouth disease Virse，FMDV)的结构蛋白P1全长基因，人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV-1)的结构蛋白gag基因、外膜糖蛋白gp120基因及gag-gp120嵌合基因克隆到含CaMV35S启动子控制下的植物表达载体中，构建了七种植物表达载体，pBI131SP1、pBI121P1、pBI121AP1、pBI121gag、pBI121gp120、pBI121gag-gp120和pBI131Sgp120，利用改进的冻融法将其导入农杆菌LBA4404和EHA105，构建了植物双元表达载体，为利用基因枪和农杆菌转化玉米、番茄提供了载体系统。以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料，诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织，以其Ⅱ型胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法和基因枪轰击法将FMDV的P1基因转化玉米，获得抗性转化再生植株25株，其中通过农杆菌转化为20株，转化频率为0.4％，基因枪转化为5株，转化频率为1.0％。GUS染色证明外源目的基因在玉米细胞中得到了表达，PCR、PCR-Southern杂交和基因组DNA点杂交及Southern blot分析证实目的基因P1已整合到转基因玉米的基因组中，获得阳性转化再生植株9株，其中农杆菌转化为8株，转化频率为0.16％，而基因枪转化为1株，转化频率为0.2％。为利用玉米作为生物反应器生产口蹄疫新型食用性疫苗作了探索性的基础研究。以番茄中蔬5号，中蔬9号，东农704和利生1号为材料，建立了番茄再生体系和遗传转化体系。通过农杆菌转化法将HIV-1的gag基因、即120基因和gag-gp120嵌合基因导入番茄，获得抗性转化再生植株13株，转化频率为1.4％。PCR、基因组DNA点杂交及PCR-Southern杂交分析证实目的基因已整合到转基因番茄的基因组中，获得阳性转化再生植株8株，其中gag-gp120基因转化为4株，gag基因转化为2株，gp120基因转化为2株，阳性转化频率为0.9％。为利用番茄作为生物反应器生产艾滋病新型口服疫苗提供了良好的基础。

关键词： FMDV HIV PI基因 gag基因 gp12基因玉米番茄疫苗

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中网豪华包厢品牌塑造研究

中网豪华包厢品牌塑造研究

作者：余云舟北京体育大学

学位级别：硕士

中网豪华包厢品牌是中网赛事品牌的重要组成部分,对中网豪华包厢进行品牌塑造不仅有利于中网豪华包厢的运营,同时也能促进中网赛事品牌的发展。就中网豪华包厢的运营现状来看,中网豪华包厢的出售率并不乐观,包厢运营收益与预期相差甚远... 详细信息

中网豪华包厢品牌是中网赛事品牌的重要组成部分,对中网豪华包厢进行品牌塑造不仅有利于中网豪华包厢的运营,同时也能促进中网赛事品牌的发展。就中网豪华包厢的运营现状来看,中网豪华包厢的出售率并不乐观,包厢运营收益与预期相差甚远,同时也没能在消费者心中形成有影响力的品牌。本文以中网豪华包厢品牌塑造为研究对象,在现有的品牌塑造理论指导下,通过对中网豪华包厢运营现状、品牌塑造现状进行分析,希望提出适合中网豪华包厢品牌塑造的相应策略,同时希望能给我国其他赛事及体育场馆的豪华包厢品牌塑造带来一定帮助。本文采用文献资料法、逻辑分析法和实地调查法等研究方法,结合品牌塑造的相关理论对中网豪华包厢的品牌塑造进行了分析和研究,发现中网豪华包厢品牌塑造现存的主要问题有：①品牌文化建设不到位,包括品牌文化定位模糊和品牌个性的缺乏;②缺乏独立的品牌标志;③产品本土化创新不足：④目标客户群定位狭窄;⑤品牌营销途径太过单一;⑥品牌管理体系不健全。本研究得出的中网豪华包厢品牌塑造策略如下：①建设品牌文化,包括了重新定位品牌文化及赋予品牌以个性;②设计品牌标志;③提升产品质量,并在产品设计中注重本土化创新;④培育境外客户;⑤扩展品牌营销渠道,尝试运用公益营销、体验营销等新型品牌营销方式;⑥加强对品牌塑造管理即健全中网豪华包厢品牌管理体系。

关键词：中国网球公开赛豪华包厢品牌品牌塑造策略

一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定

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生物工程学报 2011年第8期27卷 1191-1197页

作者：赵萌徐青于继云余云舟北京交通大学生命科学与生物工程研究院北京100044 军事医学科学院基础医学研究所北京100850 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L... 详细信息

艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α(pABK-HIV-MF)和pABK-CKR5-CD4(pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞(DC)清除研究奠定了基础。

关键词：融合基因 HIV 真核表达树突状细胞靶向

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重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究

吉林农业大学学报 2003年第3期25卷 257-259,262页

作者：余云舟杜娟王罡季静解放军军需大学植物基因工程研究中心

对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明:该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISP1,pBIP1,pBIAP1和pBISgp120分别导入根癌农... 详细信息

对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明:该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISP1,pBIP1,pBIAP1和pBISgp120分别导入根癌农杆菌EHA105和LBA4404,构建了植物双元表达载体,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化提供了良好的载体系统。

关键词：植物基因转化重组质粒根癌农杆菌冻融法转化效率

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

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生物化学与生物物理进展 2006年第1期33卷 87-94页

作者：余云舟孙志伟刘志刚俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京100071

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的... 详细信息

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.

关键词： semliki森林病毒 RNA复制子 DNA 重组病毒颗粒疫苗

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

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生物工程学报 2005年第5期21卷 713-718页

作者：余云舟孙志伟俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京100071

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该... 详细信息

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。

关键词： semliki森林病毒 RNA复制子双功能复制子载体

E型肉毒神经毒素重组Hc-C亚单位疫苗免疫原性研究

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军事医学 2019年第5期43卷 346-351页

作者：李珍徐青余云舟北京交通大学生命科学与生物工程研究院北京100044 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所北京100071

目的利用大肠杆菌高效表达并纯化E型肉毒神经毒素(BoNT/E)受体结合区Hc的亚结构域EHc C蛋白,并进行免疫原性研究。方法利用PCR技术扩增出EHc C基因,克隆于载体pTIG Trx His tag中得到重组质粒pTIG Trx EHc C,转入表达菌株BL21(DE3),经I... 详细信息

目的利用大肠杆菌高效表达并纯化E型肉毒神经毒素(BoNT/E)受体结合区Hc的亚结构域EHc C蛋白,并进行免疫原性研究。方法利用PCR技术扩增出EHc C基因,克隆于载体pTIG Trx His tag中得到重组质粒pTIG Trx EHc C,转入表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,超声破碎菌体,收集上清,经镍柱亲和纯化获得重组抗原EHc C蛋白,通过SDS PAGE和Western印迹检测纯化效果,之后免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果通过原核表达纯化获得了纯度>90%的重组抗原EHc C蛋白,该重组抗原作为亚单位疫苗免疫小鼠产生了特异性抗体反应,10μg剂量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104 LD50E型肉毒毒素攻击,血清中和抗体效价可达1.00 U/ml。结论获得的重组EHc C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻击,产生强烈保护作用,可作为亚单位候选疫苗预防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗体的功能表位。

关键词：肉毒毒素类免疫原性原核表达亲和纯化疫苗,亚单位重组抗原EHc C蛋白

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

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生物工程学报 2008年第1期24卷 124-129页

作者：余云舟孙志伟王双俞炜源北京生物工程研究所北京100071

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和... 详细信息

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测,结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达;而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒,该重组病毒颗粒感染细胞后,也都能表达Hc抗原。以上结果表明,基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得,为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础,从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。

关键词： semliki森林病毒复制子 A型肉毒毒素受体结合区Hc 重组病毒颗粒

用基因枪法将Bt杀虫基因导入玉米自交系的研究

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吉林农业大学学报 2003年第3期25卷 260-262页

作者：杜娟胡汉桥余云舟季静王罡解放军军需大学植物基因工程研究中心吉林长春130062

利用PDS1000/氦气基因枪将人工合成的Bt基因导入玉米自交系340,8902,吉853,Mo17等的愈伤组织,在含有除草剂Basta2～5mg/L的培养基上筛选与分化。经3轮的除草剂筛选获得1840块抗性愈伤组织,再生860个植株。Southernblot分析证明,3个植株... 详细信息

利用PDS1000/氦气基因枪将人工合成的Bt基因导入玉米自交系340,8902,吉853,Mo17等的愈伤组织,在含有除草剂Basta2～5mg/L的培养基上筛选与分化。经3轮的除草剂筛选获得1840块抗性愈伤组织,再生860个植株。Southernblot分析证明,3个植株中整合有Bt基因。

关键词： Bt杀虫基因玉米自交系转基因基因枪法玉米螟