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应用实时PCR检测红鹿感染牛型结核杆菌后IFN-γ和IL-4mRNA的表达

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中国人兽共患病杂志 2003年第6期19卷 49-51,20页

作者：朱苹佘菲菲 Frank Griffin 福建医科大学病原生物学系福州350004 University of Otago

目的　揭示红鹿抗结核杆菌感染的免疫反应途径。方法　共采用 2 0只红鹿 ,其中一组 10只对牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis,M bovis)有自然抵抗力 ,另一组 10只对M bovis敏感。两组各取 5只接种活的卡介苗 (BCG) ,余下 5只不接种。... 详细信息

目的　揭示红鹿抗结核杆菌感染的免疫反应途径。方法　共采用 2 0只红鹿 ,其中一组 10只对牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis,M bovis)有自然抵抗力 ,另一组 10只对M bovis敏感。两组各取 5只接种活的卡介苗 (BCG) ,余下 5只不接种。接种卡介苗 8周后所有的红鹿都注射有毒力的M bovis,在注射M bovis4周前以及 6周后分别收集外周血单核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC) ,PBMC在与美洲商陆原 (PokeweedMitogen ,PWM)共育后测定细胞因子Inter feron -γ(IFN -γ)和Interleukin - 4 (IL - 4 )mRNA的表达水平。mRNA的定量测定是在ABIPRISM 770 0序列检测系统上应用TaqManReal-time11PCR技术进行的。结果　在红鹿接受M bovis刺激前后PBMC中IFN -γ和IL - 4mRNA的表达水平有显著性差异。结论　红鹿抵抗结核杆菌感染的免疫反应是复杂的混合细胞反应型 ,Th1,Th2细胞反应均加强。

关键词： PCR 检测红鹿牛型结核杆菌感染 IFN-γ IL-4 基因表达结核病

幽门螺杆菌jhp947基因对C57BL/6小鼠致病性研究

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微生物学报 2009年第8期49卷 1109-1114页

作者：孙各琴佘菲菲李能陈豪福建医科大学病原生物学系福建省高校感染与肿瘤重点实验室福州350004

检测jhp947对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)所致动物胃上皮细胞病变和基因表达的影响。【方法】将27只无特定病原体的(specified-pathogens free,SPF)6W龄C57BL/6小鼠随机分成3组,分别以J99、△J99-947(缺失jhp947基因)和PBS灌胃,菌量为109CFU/mL,0、2、4d各一次,4W后宰杀所有小鼠,无菌操作取胃组织,分别作快速尿素酶试验,Hp培养,组织病理学检查;免疫组化检测ESE-3A、NDRG1、MATP基因表达;半定量RT-PCR检测jhp947基因对小鼠ESE-3A、NADG1、MATP等基因转录的影响。【结果】J99组和△J99-947组快速尿素酶试验和Hp培养的阳性率均为100%,PBS对照组快速尿素酶试验和Hp培养阴性。组织病理学检查,PBS对照组小鼠胃黏膜100%正常,J99组小鼠胃黏膜33.3%(3/9)轻度糜烂,66.7%(6/9)重度糜烂。△J99-947组小鼠胃黏膜22.2%(2/9)正常,77.8%(7/9)轻度糜烂,没有重度糜烂。J99组小鼠胃黏膜的损伤比△J99-947组重。免疫组化检测结果,J99组比△J99-947组ESE-3A、NDRG1、MATP表达显著降低(P<0.05)。半定量RT-PCR检测结果,J99组比△J99-947组ESE-3A、NDRG1、MATP表达显著降低(P<0.05)。【结论】JHP947基因存在可使Hp感染所致的胃黏膜损伤程度加重。在体内jhp947基因可能通过下调NDRG1、MATP等肿瘤抑制基因的表达,这可能与胃癌的发生有关。

关键词：幽门螺杆菌 jhp947 动物实验基因表达

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全基因组预测幽门螺杆菌的分泌蛋白

中国人兽共患病学报 2008年第7期24卷 607-611页

作者：陈建森佘菲菲福建医科大学基础医学院病原生物学系

目的运用生物信息学方法预测幽门螺杆菌分泌蛋白,为后续研究奠定基础。方法用Signalp和TMHMM两个软件对幽门螺杆菌全基因组开放读码框(ORFs)进行预测,Microsoft Access数据库分析处理以识别分泌蛋白,再与HpNCTC26695二维凝胶电泳质谱鉴... 详细信息

目的运用生物信息学方法预测幽门螺杆菌分泌蛋白,为后续研究奠定基础。方法用Signalp和TMHMM两个软件对幽门螺杆菌全基因组开放读码框(ORFs)进行预测,Microsoft Access数据库分析处理以识别分泌蛋白,再与HpNCTC26695二维凝胶电泳质谱鉴定蛋白质组数据库(2DE-MS)和免疫蛋白质组研究结果进行比对验证。结果从Hp的1587个编码蛋白的ORFs中预测出191种分泌蛋白,其中27个预测蛋白与二维凝胶电泳质谱鉴定(2DE-MS)的Hp蛋白数据库中的蛋白一致;13个预测蛋白出现在高抗原性的免疫蛋白质组中。结论生物信息学方法可作为研究分泌蛋白的辅助工具,并可为研制Hp诊断试剂和疫苗提供候选抗原。

关键词：幽门螺杆菌分泌蛋白信号肽生物信忠学

OipA DNA疫苗抗螺旋形和球形幽门螺杆菌免疫保护作用及其机制

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第4期26卷 328-333页

作者：佘菲菲吴小茜陈豪陈月秀福建医科大学分子医学微生物学实验室福州350004

目的探讨pcDNA3．1-oipA DNA疫苗在抗螺旋形与球形幽门螺杆菌(Hp)感染中的作用及其机制。方法抽提并纯化可表达OipA蛋白的重组质粒pcDNA3．1-oipA,以金粉包裹后,用基因枪接种BALB／c小鼠,5μg/只,接种2次,以pcDNA3．1(空载组)作对照。... 详细信息

目的探讨pcDNA3．1-oipA DNA疫苗在抗螺旋形与球形幽门螺杆菌(Hp)感染中的作用及其机制。方法抽提并纯化可表达OipA蛋白的重组质粒pcDNA3．1-oipA,以金粉包裹后,用基因枪接种BALB／c小鼠,5μg/只,接种2次,以pcDNA3．1(空载组)作对照。对免疫小鼠进行:(1)免疫保护实验: 于末次免疫后8周,分别给予螺旋形及球形HpSS1攻击4次,于末次攻击4周后取胃组织做细菌学(组织尿素酶试验、细菌培养)及病理学检测。(2)小鼠免疫指标检测:分别于末次免疫后2、8、12周采集小鼠血清,用ELISA法检测其抗Hp OipA IgA、IgG、IgG1抗体。于末次免疫后12周,取脾细胞,用ELISA法检测 IFN-γ、IL-2的含量;用流式细胞术检测CD4^+／CD8^+T淋巴细胞的比值。结果以螺旋形及球形Hp攻击的免疫小鼠,快速尿素酶实验阳性率分别为20％和10％;细菌培养阳性率分别为60％和50％,与空载组比较P<0．05。空载组小鼠胃黏膜均出现轻度或重度糜烂,而以螺旋形Hp攻击的实验组小鼠50％胃黏膜正常,以球形Hp攻击的实验组小鼠60％胃黏膜正常,与空载组比较P<0．050小鼠免疫指标检测结果:免疫后8周,产生了抗OipA的特异性IgA、IgG、IgG1抗体,抗体滴度比对照组高2倍以上;脾细胞中 CD4^+／CD8^+T淋巴细胞的比值升高;脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-2的含量明显高于对照组(P<0．05)。结论pcDNA3．1-oipA DNA疫苗能有效诱导免疫小鼠产生体液与细胞免疫并使小鼠兼具一定的抗螺旋形及球形Hp感染的能力。

关键词：幽门螺杆菌 OipA DNA疫苗免疫保护

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两种念珠菌DNA探针的研制及应用

临床检验杂志 2001年第2期19卷 77-78页

作者：佘菲菲沈建箴吕联煌朱苹陈月秀福建医科大学微生物学教研室福州350004 福建医科大学附属协和医院血研所

目的制备两种念珠菌ＤＮＡ探针并应用于临床诊断。方法对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的Ｅ０３基因的１２５ｂｐ片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的Ｅ０３基因中２５ｂｐ特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色... 详细信息

目的制备两种念珠菌ＤＮＡ探针并应用于临床诊断。方法对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的Ｅ０３基因的１２５ｂｐ片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的Ｅ０３基因中２５ｂｐ特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与２３株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果Ｄｉｇ－１２５ｂｐＤＮＡ探针显色敏感度为０．０１ｐｇ，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。Ｂｉｏ－２５ｂｐＤＮＡ探针显色敏感度为２０ｐｇ，与白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论Ｂｉｏ－２５ｂｐＤＮＡ探针可用于念珠菌初步鉴定，而Ｄｉｇ－１２５ｂｐＤＮＡ探针可用于白色念珠菌的鉴定。

关键词：念珠菌 DNA探针杂交 PCR 寡核苷酸

幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析

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中国免疫学杂志 2009年第4期25卷 351-355页

作者：佘菲菲李妮林旭陈豪福建医科大学病原生物学系福建省感染与肿瘤重点实验室福州350004

目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段。方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连... 详细信息

目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段。方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连接,转化大肠杆菌BL-21,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白肽段的表达,经Western Breeze化学发光法鉴定融合蛋白;优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;Ni-NTA His·Bind树脂亲和纯化表达产物;羊抗Hp多克隆抗体,Western blot法检测纯化蛋白的抗原性,间接ELISA法筛选抗原性最强的重组肽段。结果:6条oipA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达,表达的蛋白肽段均可被抗Hp多克隆抗体识别,具有抗原性,其中反应性最强的是最小的蛋白肽段。结论:oipA基因片段可在原核系统中表达,所获取的最小的肽段抗原性最强,可望制备检测血清相应抗体的试剂盒。

关键词：幽门螺杆菌 oipA基因片段克隆表达抗原性

幽门螺杆菌cagA基因稳定转染胃上皮细胞及其对细胞的作用

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中国人兽共患病学报 2006年第1期22卷 29-32页

作者：佘菲菲张静陈月秀陈豪福建医科大学分子医学微生物学实验室福州350004 福建医科大学老年医学研究所

目的研究幽门螺杆菌(Hp)cagA基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用。方法用PCR方法从Hp标准株NCTC11637中获取cagA全长基因,将其3.4kb的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1;获得的重组子转染SGC-7901细胞,筛选耐潮霉... 详细信息

目的研究幽门螺杆菌(Hp)cagA基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用。方法用PCR方法从Hp标准株NCTC11637中获取cagA全长基因,将其3.4kb的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1;获得的重组子转染SGC-7901细胞,筛选耐潮霉素的细胞克隆,用RT-PCR方法检测细胞内cagA基因在转录水平的表达;用荧光染色技术、MTT、流式细胞术检测CagA对细胞表型、增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果CagA阳性表达的细胞(ScagA)体积变大、胞浆出现空泡样变、胞膜出芽、细胞皱缩;用MTT法检测细胞增殖:ScagA细胞较SpcDNA3.1细胞(pcDNA3.1转染的细胞)生长增殖明显缓慢(P=0.009),表明ScagA细胞生长受抑制;流式细胞检测细胞凋亡结果:ScagA的凋亡率显著高于SpcD-NA3.1(P值:0.02);细胞周期分析显示:ScagA细胞有S期比率增高、G2-M、G0-G1期比率下降的趋势。结论cagA开放读码框架在培养细胞内的表达可引起细胞表型转变、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。

关键词：幽门螺杆菌 CagA 细胞增殖细胞凋亡基因转染

幽门螺杆菌cagAM1′基因表达抗原的纯化及应用

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中国人兽共患病杂志 2005年第6期21卷 495-497页

作者：张静陈月秀佘菲菲福建医科大学附属协和医院老年医学研究所福州350001 福建医科大学福州350004

目的克隆cagAM1′基因,以其表达的蛋白为抗原,通过血清学方法检测幽门螺杆菌(Hp)cagA阳性菌株的感染。方法以既往克隆的cagAM1基因为模板设计引物,PCR扩增681bpcagAM1′基因,将其定向连接入载体pET-42a(+),转化宿主菌BL21,用IPTG诱导融... 详细信息

目的克隆cagAM1′基因,以其表达的蛋白为抗原,通过血清学方法检测幽门螺杆菌(Hp)cagA阳性菌株的感染。方法以既往克隆的cagAM1基因为模板设计引物,PCR扩增681bpcagAM1′基因,将其定向连接入载体pET-42a(+),转化宿主菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达。可溶部分的表达产物用GST·Tag方法纯化。以该纯化抗原经WesternBlot方法,检测39份Hp培养阳性(其中28份cagA基因阳性,11份阴性)及17份无Hp感染患者的血清,以鉴定抗原检测的敏感性和特异性。同时用进口试剂盒进行对照实验。结果获得62kD的CagAM1′与GST融合蛋白,以此为抗原,28株cagA阳性患者的血清26份检出抗cagA抗体,表明cagAM1′蛋白具有抗原性,且该抗原检测相应抗体的敏感性为92.9%,高于进口试剂盒(71.4%),17份无Hp感染患者的血清14份抗cagA抗体阴性,表明该抗原检测相应抗体的特异性为82.4%,高于进口试剂盒(52.9%)。结论cagAM1′蛋白有望进一步开发用于临床Hp高毒株感染诊断。

关键词：幽门螺杆菌 CagA 血清学诊断

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幽门螺杆菌的球形变异及其特征和意义

中国微生态学杂志 2001年第5期13卷 299-300页

作者：佘菲菲福建医科大学微生物学教研室福州350004

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)在不利于其生长繁殖的环境中易发生球形变异,如延长培养时间、进入无营养成分的水中、改变环境氧浓度、接触抗生素等均可使Hp转变为球形菌.球形Hp在体外常规培养条件下不能繁殖,但具有活力,具有... 详细信息

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)在不利于其生长繁殖的环境中易发生球形变异,如延长培养时间、进入无营养成分的水中、改变环境氧浓度、接触抗生素等均可使Hp转变为球形菌.球形Hp在体外常规培养条件下不能繁殖,但具有活力,具有低代谢活性,在水中可存活较长时间,进入动物体内可致动物模型胃炎,推测球形Hp在体内适宜的环境下可回复转变为螺旋菌,从而导致胃炎等消化性疾病的发生,因而认为球形菌可能在Hp感染的传播中起重要作用.临床化学治疗剂的应用,使Hp在化学治疗压力作用下转化为球形,并潜伏于机体内,成为日后消化性疾病复发的主要原因.因而球形Hp具有重要的流行病学和病因学意义.

关键词：幽门螺杆菌球形变异形态活力致病性