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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2023年第23期56卷 4684-4695页

作者：苏琦汤亚飞佘小漫蓝国兵于琳吴正伟李正刚何自福广东海洋大学滨海农业学院广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和... 详细信息

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus,ZTMV）(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒（watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV）(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV）(3.8%)、甜瓜黄斑病毒（melon yellow spot virus,MYSV）(1.3%)。78份样品中，复合侵染率高达80.8%，其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物，引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL，从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种，其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒；复合侵染现象较普遍，以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高；研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术，提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

关键词：蒲瓜病毒病小RNA深度测序 RT-PCR检测多重PCR方法

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作物青枯病研究进展

广东农业科学 2020年第12期47卷 82-89页

作者：佘小漫何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病是世界性、毁灭性的作物细菌病害,该病害是典型的土传病害。茄科雷尔氏菌属薄壁菌门β-变形菌纲雷尔氏菌属,为革兰氏阴性、好氧棒状杆菌,可侵染50多科200余种植物。该病原菌在无寄主植物存在时可在土壤、... 详细信息

茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病是世界性、毁灭性的作物细菌病害,该病害是典型的土传病害。茄科雷尔氏菌属薄壁菌门β-变形菌纲雷尔氏菌属,为革兰氏阴性、好氧棒状杆菌,可侵染50多科200余种植物。该病原菌在无寄主植物存在时可在土壤、水体中存活5年以上,一旦有合适的寄主植物,即可通过寄主植物的根部侵染维管束系统,引起寄主植物整株性、不可逆的萎蔫枯死。茄科雷尔氏菌是一个复合种,具有明显的生理分化与遗传多样性,已发现有5个生理小种、5个生化变种、4个演化型和57个序列变种。作物青枯病在广东省多种作物上发生十分严重,是广东省重要的植物细菌病害之一。目前,至少发现有35种植物受到茄科雷尔氏菌的侵染与为害,其中桑、桉树、甘薯、沙姜、南瓜、空心菜、菊花、向日葵、广藿香、胜红蓟和人参果等作物青枯病被首次发现与报道,每年均造成巨大的经济损失。对国内外茄科雷尔氏菌及青枯病主要研究进展进行综述,并总结了本团队近20年来在青枯病研究方面取得的主要成效。

关键词：茄科雷尔氏菌多样性生理生化特性分子特征青枯病防控技术

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番茄斑驳花叶病毒在广东省的首次报道

植物保护 2023年第3期49卷 219-225页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵李战彪何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所广西作物病虫害生物学重点实验室南宁530007

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病... 详细信息

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病毒广东分离物(ToMMV-GD-2020)。采用RT-PCR分段扩增获得了ToMMV-GD-2020的基因组全序列,该分离物基因组全长6 399 nt,包含4个开放阅读框,分别编码4个蛋白。序列相似性分析表明,ToMMV-GD-2020与已登录GenBank的14个ToMMV分离物基因组序列相似性分别为99.0%~99.7%,其中与中国辽宁分离物ToMMV-LN(GenBank登录号:MN853592)的相似性最高(99.7%),与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)代表分离物的相似性分别为84.6%和81.0%。系统进化分析表明,ToMMV-GD-2020与该病毒各分离物亲缘关系均较近,与中国辽宁分离物亲缘关系最近。利用ToMMV的PCR特异引物对广东其他6个市采集的67份辣椒疑似病毒病样品进行检测,结果均为阴性,这说明ToMMV目前还是局部危害广东省辣椒。本文是首次报道在广东发现ToMMV,对监测ToMMV在我国的扩散具有重要意义。

关键词：番茄斑驳花叶病毒辣椒分子鉴定病毒基因组序列

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胜红蓟青枯病病原鉴定及其生物学特性

植物保护学报 2013年第6期40卷 533-539页

作者：佘小漫何自福罗方芳广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

胜红蓟青枯病是我国发生的一种新病害。为了明确引起胜红蓟青枯病的病原，对分离自广东的胜红蓟青枯病菌的菌落形态、16S rDNA序列、碳水化合物利用、致病性及演化型等进行了分析。在含1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑选择性培养基平板上... 详细信息

胜红蓟青枯病是我国发生的一种新病害。为了明确引起胜红蓟青枯病的病原，对分离自广东的胜红蓟青枯病菌的菌落形态、16S rDNA序列、碳水化合物利用、致病性及演化型等进行了分析。在含1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑选择性培养基平板上，病原菌的菌落呈近圆形或梭形，隆起，中间粉红色，周围乳白色。应用细菌通用引物27f和1541r扩增16S rDNA，Ac-YcSj-11-1~Ac-YcSj-11-10 10个菌株的16S rDNA近全长均为1 421 bp，且与茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum GMI1000 16S rDNA的同源率为100%。该病原菌可以利用麦芽糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇和卫矛醇等6种碳水化合物，并可侵染姜、沙姜、番茄，弱侵染茄子、辣椒。10个菌株均可同时扩增得到144 bp的演化型Ⅰ特异带和280 bp的茄科雷尔氏菌特异带。研究表明，引起广东胜红蓟青枯病的病原菌为茄科雷尔氏菌***，且属于4号生理小种、生化变种Ⅲ和演化型Ⅰ（亚洲组）。

关键词：胜红蓟青枯病病原鉴定茄科雷尔氏菌

我国46个棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒的抗性鉴定

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植物保护学报 2017年第4期44卷 601-608页

作者：汤亚飞何自福佘小漫蓝国兵广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为明确我国主要棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的抗性水平,采用烟粉虱田间自然传毒和CLCuMuV侵染性克隆人工接种方法分别对收集的46个棉花品种进行抗性鉴定。结果显示:46个棉花品种田间播种后90... 详细信息

为明确我国主要棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的抗性水平,采用烟粉虱田间自然传毒和CLCuMuV侵染性克隆人工接种方法分别对收集的46个棉花品种进行抗性鉴定。结果显示:46个棉花品种田间播种后90 d,新海21号、新海31号、新37号及112-2号4个品种自然发病的病株率为41.70%~100.00%,病情指数为39.81~100.00;新陆早36号、新陆中52号、中棉35号、中棉43号、鲁棉研36号、金宏祥10号6个品种的病株率为8.30%~16.70%,病情指数为0.93~9.26;其余品种未见发病。46个棉花品种人工接种CLCuMuV后60 d,新海21号、新海31号、新海37号和112-2号4个品种的病情指数为75.00~100.00,表现为高感;新陆中66号和新陆早46号病情指数分别为20.83和20.37,表现为中感;新陆早62号等10个品种的病情指数为10.46~15.87,表现为中抗;新陆早47号等14个品种的病情指数为5.26~9.26,表现为抗病;豫棉15号等11个品种的病情指数为2.22~4.86,表现为高抗;新陆早13号、新陆早61号、新陆中32号、新陆中56号和中棉41号病情指数均为0,表现为免疫。

关键词：棉花品种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆农杆菌注射接种抗性鉴定

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空心菜青枯病的初步研究

植物病理学报 2005年第S1期35卷 190-191页

作者：何自福虞皓罗方芳佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广州510640

空心菜(Ipomoea aquatica Forsk),又称蕹菜、瓮菜和通菜,属旋花科一年生蔓性草本植物,其原产于中国大陆。空心菜是人们喜爱的蔬菜品种之一,在我国南方各地均有栽种,而广东一年四季都有生产,且近年来在广东番禺和花都等菜区还大面积栽培... 详细信息

空心菜(Ipomoea aquatica Forsk),又称蕹菜、瓮菜和通菜,属旋花科一年生蔓性草本植物,其原产于中国大陆。空心菜是人们喜爱的蔬菜品种之一,在我国南方各地均有栽种,而广东一年四季都有生产,且近年来在广东番禺和花都等菜区还大面积栽培,已成为当地极具特色的蔬菜作物之一。 2001年,在广东番禺菜区首次出现空心菜青枯病,2003年和2004年田间发生严重。为此,我们对引起空心菜青枯病的病原及其为害进行了研究。

关键词：空心菜田间广东番禺蕹菜青枯病黄麻枯萎病青枯病菌菜区

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广东广藿香青枯病病原菌鉴定

植物病理学报 2012年第6期42卷 569-576页

作者：佘小漫何自福罗方芳广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

广藿香青枯病是近几年在广东广藿香种植区发生的新病害,细菌学鉴定及致病性测定结果表明,该病害是由茄科雷尔氏菌侵染引起的,且属于1号生理小种和生化变种Ⅲ;分子生物学分析结果进一步显示,广藿香青枯病菌属茄科雷尔氏菌演化型Ⅰ即亚洲... 详细信息

广藿香青枯病是近几年在广东广藿香种植区发生的新病害,细菌学鉴定及致病性测定结果表明,该病害是由茄科雷尔氏菌侵染引起的,且属于1号生理小种和生化变种Ⅲ;分子生物学分析结果进一步显示,广藿香青枯病菌属茄科雷尔氏菌演化型Ⅰ即亚洲分支菌株、序列变种44或序列变种17。

关键词：广藿香青枯病病原鉴定茄科雷尔氏菌

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瓜类枯萎病及其综合防治技术

广东农业科学 2011年第2期38卷 84-87页

作者：佘小漫何自福罗方芳虞皓广东省农科院植物保护研究所广东广州510640

瓜类枯萎病是广东瓜类作物上主要病害,每年均造成较严重的经济损失。阐述了瓜类枯萎病的症状、病原特性、致病机理、病害侵染循环及发生规律,并提出了瓜类枯萎病的综合防治技术措施。

关键词：瓜类枯萎病综合防治

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侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定

植物保护 2017年第2期43卷 133-137页

作者：汤亚飞何自福佘小漫蓝国兵广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

在广东番茄上发现一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RT-PCR检测,结果表明,从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DN... 详细信息

在广东番茄上发现一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RT-PCR检测,结果表明,从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DNA特异片段。对其中1份样品的扩增片段进行克隆与序列分析,结果表明,扩增片段包括1个长度为1 665个核苷酸的完整病毒基因,其核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70基因有较高的同源性,表明广东番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV广东番茄分离物的HSP70序列与国内外已报道的各分离物的同源性均低于82%,存在较大差异,其中与塞浦路斯tomato、约旦JU_20分离物的同源性最高,为81.8%。这是ToCV在广东发生的首次报道,也是该病毒HSP70基因序列存在显著差异分离物的首次发现。

关键词：番茄病毒病番茄褪绿病毒 HSP70基因