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胃粘膜癌变细胞的拉曼光谱研究

胃粘膜癌变细胞的拉曼光谱研究

作者：代剑华第三军医大学

学位级别：硕士

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球的患病率和病死率均较高,我国也属胃癌的高发地区。胃癌的发生往往要经过正常胃粘膜--萎缩--肠化--不典型增生--癌变,癌变后的胃粘膜细胞根据恶性程度可分为高、中、低、未分化。各种病变细胞的产生都... 详细信息

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球的患病率和病死率均较高,我国也属胃癌的高发地区。胃癌的发生往往要经过正常胃粘膜--萎缩--肠化--不典型增生--癌变,癌变后的胃粘膜细胞根据恶性程度可分为高、中、低、未分化。各种病变细胞的产生都是其内部结构发生变化的体现。通过研究不同阶段的细胞结构特征,可以更好地理解胃癌的发生过程。拉曼光谱就是一种非常好的研究物质空间结构的方法,它是由分子对入射光发生的高频非弹性散射现象所形成的发射光谱。拉曼光谱用于生物样品测试具有很多优势,比如:对生物样品要求较低--样品形态可以是气体、液体或固体;样品需要量少,可以是微量或痕量;不易受水的干扰,能用于水环境中检测;对样品无损伤;测试速度快,能实现生物体的实时诊断、细胞的动态观察、使用近红外激光可避免荧光干扰等。拉曼光谱技术正好能满足生物样品测试的要求,已被广泛地应用到生物医学领域。目前,拉曼光谱已用于组织、细胞等的研究,通过测得的光谱分析结构特征,观察动态变化情况等。但对于胃粘膜细胞从正常发展到癌症过程中,各种特征性拉曼光谱的研究还甚少。我们对胃粘膜正常、肠化、癌变的组织细胞和基因组DNA,以及不同分化程度的胃癌细胞株基因组DNA的拉曼光谱进行判别、分析,主要结果如下: 1.通过采用激光共聚焦拉曼光谱仪,检测胃粘膜正常组织、肠化组织及腺癌组织的HE染色切片中的特征性细胞的细胞核的拉曼光谱。通过比较分析,结果提示:正常和肠化组织切片中检测到的拉曼光谱比较相似,而癌变组织中的拉曼光谱明显不同于前两种,可以很好地区分开。癌变组织中的拉曼谱特征峰主要表现在: 1)60000cm、963cm表现出相对强度更强的谱峰;表明癌变组织中核酸、蛋白质、类胡萝卜素含量更高;2)在1090 cm处谱峰强度下降并位移到1088 cm附近,提示其DNA单、双链发生了断裂;3)在1610 cm处谱带强度明显弱于1526 cm处的谱带强度,正常组织中则相反,这表明蛋白质在癌变组织中相对于脂类类胡萝卜素的含量减少。 2.通过将组织细胞基因组DNA提取技术与拉曼光谱检测相结合的办法,将胃粘膜正常组织、肠化组织及癌变组织的基因组DNA提取液用于拉曼检测,对各拉曼谱峰进行分析,结果提示:胃粘膜正常组织基因组DNA有稳定的磷酸骨架;肠化组织基因组DNA的拉曼特征峰在1090 cm处谱峰强度低于1050 cm处谱峰强度,表明其磷酸骨架变得不稳定;腺癌组织基因组DNA拉曼特征峰在1090 cm附近出现双峰,其相对于1050 cm处谱峰强度更强,提示DNA有可能出现断链并再次形成了稳定的磷酸骨架,在950 cm、1010 cm、1100600 cm波段的特征谱峰与正常组织DNA相比变化也较大,说明脱氧核糖和碱基可能由于DNA断链而引起结构对称性的变化。我们可以推断胃癌发生过程中DNA结构变化过程可能是:胃粘膜正常组织具有稳定的DNA磷酸骨架,在致病因素作用下发展为具有不稳定磷酸骨架DNA的肠化组织,最后组织DNA磷酸骨架断裂并重新形成稳定的DNA磷酸骨架,致胃癌发生。 3.通过培养胃粘膜正常上皮细胞株(GES)、高分化胃癌细胞株(MKN-28)、中分化胃癌细胞株(SGC-7901)、低分化胃癌细胞株(BGC-823)和未分化胃癌细胞株(HGC-27),并分别进行细胞基因组DNA的提取,将提取液应用表面增强拉曼光谱技术进行检测。对各拉曼谱峰分析结果发现:与正常胃粘膜细胞比,高分化细胞基因组DNA拉曼谱图除在1010 cm处被增强外,两者光谱谱图极为相似;中、低、未分化细胞基因组DNA拉曼谱图在750-800 cm、890 cm、960 cm、1010cm处出现渐强的谱峰,1060 cm、1090 cm处可见较弱的谱峰。这些特征峰可提示恶性程度越高的细胞基因组DNA具有更多的振动模式被激活,相对强度也越强;分化程度越低的细胞基因组DNA结构排列越多样化,甚至是断链;同时,与正常细胞相比,DNA的整体带电性也可能发生了变化。系统研究胃粘膜癌变过程中的各种拉曼光谱,有利于我们更好地认识其结构变化特征,对拉曼光谱应用到临床疾病的实时诊断、早期诊断,研究发病机制,观察药物疗效等方面都有指导意义。本论文应用拉曼光谱技术探测了胃粘膜正常、肠化和癌变的组织细胞和基因组DNA,以及不同分化程度的胃癌细胞株基因组DNA,为胃癌发病机制的探讨、临床早期诊断的研究等提供了新的思路。

关键词：拉曼光谱表面增强拉曼光谱胃粘膜细胞肠化癌变基因组DNA

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开展班主任工作赏识教育的作用与运用

中国科技经济新闻数据库教育 2021年第5期 178-179页

作者：代剑华弥勒市第四中学云南红河652399

班主任对学生个体的成长起着不可忽视的作用。每个学生都存在着差异性,班主任在工作中应充分运用赏识教育,发现每个学生的优点。本文主要分析了赏识教育对教师工作的作用,以及班级教师如何运用赏识教育提高班主任工作的质量和效果。

关键词：班主任工作赏识教育

胃粘膜正常、肠化和腺癌组织基因组DNA的拉曼光谱分析

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光电工程 2010年第4期37卷 25-29页

作者：代剑华饶云江冉曾令张衍亮薛世祥彭贵勇第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038 电子科技大学光纤宽带传输与通信网技术教育部重点实验室成都611731 ThermoFisher公司上海201206

本文提出结合生物组织DNA提取技术和拉曼光谱技术来系统研究胃癌不同发生过程中的组织DNA空间结构的方法。实验中,首先提取涉及胃癌发病过程中的胃粘膜正常上皮组织、肠化组织和腺癌组织的基因组DNA,分别对其进行拉曼光谱检测,根据拉曼... 详细信息

本文提出结合生物组织DNA提取技术和拉曼光谱技术来系统研究胃癌不同发生过程中的组织DNA空间结构的方法。实验中,首先提取涉及胃癌发病过程中的胃粘膜正常上皮组织、肠化组织和腺癌组织的基因组DNA,分别对其进行拉曼光谱检测,根据拉曼谱图特征,详细分析了基因组DNA的结构变化。实验结果表明,胃粘膜正常组织DNA中有稳定的磷酸骨架;肠化组织基因组DNA拉曼特征峰在1090cm^-1处谱峰强度低于1050cm^-1处谱峰强度,表明其磷酸骨架变得不稳定,其它位置的谱峰与正常组织相似;腺癌组织基因组DNA拉曼特征峰在1090cm^-1附近出现双峰,其相对于1050cm^-1处谱峰强度更强,提示DNA有可能出现断链并再次形成了稳定的磷酸骨架,在950cm^-1、1010cm^-1、1100-1600cm^-1波段的特征谱峰与正常组织DNA相比变化也较大,说明脱氧核糖和碱基可能由于DNA断链也随之改变。这些结果提示胃癌的发生过程中DNA结构变化过程可能是：胃粘膜正常组织具有稳定的DNA磷酸骨架,在致病因素作用下发展为具有不稳定磷酸骨架DNA的肠化组织,最后组织DNA磷酸骨架断裂并重新形成稳定的DNA磷酸骨架,致胃癌发生。

关键词：胃粘膜肠化腺癌基因组DNA 拉曼光谱

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氩离子凝固术治疗食管病变的安全性研究

第三军医大学学报 2013年第10期35卷 1009-1013页

作者：康秀峰刘培君袁月王志中代剑华彭贵勇第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038 天水市第一人民医院心内科甘肃天水741000

目的研究氩离子凝固器不同输出参数对活体犬食管损伤的影响,探讨氩离子凝固术(argon plasma coagu-lation,APC)治疗食管疾病的安全范围。方法①采用氩离子凝固器,通过选择不同的输出功率(50、60、70、80 W)、氩气流量(1.6、2.0、2.4 L/m... 详细信息

目的研究氩离子凝固器不同输出参数对活体犬食管损伤的影响,探讨氩离子凝固术(argon plasma coagu-lation,APC)治疗食管疾病的安全范围。方法①采用氩离子凝固器,通过选择不同的输出功率(50、60、70、80 W)、氩气流量(1.6、2.0、2.4 L/min)及作用时间(2、4 s),对3只活体犬食管黏膜进行凝固,切片HE染色,光学显微镜下观察组织损伤深度。②固定氩气流量(2.0 L/min)与作用时间(3 s),选择不同输出功率(50、60、70、80、90、100 W),对2只活体犬食管黏膜切片进行HE染色,光学显微镜下观察组织损伤深度。③将8只活体犬分为2组,采用60 W(2 L、3 s)与70 W(2 L、3 s)输出参数对2组犬食管黏膜(距门齿40 cm处)进行环形烧灼,第2、4周时用胃镜与超声胃镜观察黏膜瘢痕增生及食管狭窄情况。结果①APC输出功率、氩气流量及持续作用时间与食管组织损伤深度之间均存在正相关关系,其中功率变化对损伤深度的影响最大;②氩气流量及作用时间固定的条件下,功率增加,食管组织损伤深度相应增加,在70～90 W内,功率变化而组织损伤变化不显著;③APC输出参数为60、70 W(2 L、3 s)作用于犬食管黏膜,第2、4周时观察,70 W(2 L、3 s)作用后均显示食管损伤部位瘢痕增生,管腔狭窄而60 W(2 L、3 s)作用后瘢痕增生,管腔狭窄均不明显。结论通过选择合适的APC输出参数,可控制食管损伤程度,当输出功率≤60 W时可有效预防APC术后食管狭窄等并发症的发生。

关键词：氩离子凝固术食管损伤并发症预防

内镜和腹腔镜及开腹手术治疗胃间质瘤的临床疗效

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中华消化外科杂志 2018年第8期17卷 843-847页

作者：何天湖汤旭东龙庆林陈军代剑华陆军军医大学第一附属医院全军消化病研究所重庆400038 陆军军医大学第一附属医院全军普通外科中心重庆400038

目的：探讨内镜、腹腔镜及开腹手术治疗胃间质瘤的临床疗效。方法：采用回顾性横断面研究方法。收集2007年1月至2017年6月陆军军医大学第一附属医院收治的254例胃间质瘤患者的临床病理资料。根据患者具体情况行内镜黏膜下切除术（ESD）... 详细信息

目的：探讨内镜、腹腔镜及开腹手术治疗胃间质瘤的临床疗效。方法：采用回顾性横断面研究方法。收集2007年1月至2017年6月陆军军医大学第一附属医院收治的254例胃间质瘤患者的临床病理资料。根据患者具体情况行内镜黏膜下切除术（ESD）、腹腔镜或开腹胃间质瘤楔形切除术。观察指标：（1）手术及术后恢复情况。（2）术后病理学检查情况。（3）随访和生存情况。采用门诊和电话方式进行随访，了解患者术后辅助治疗情况和生存情况。随访时间截至2017年6月。正态分布的计量资料采用x^-±s表示，偏态分布的计量资料采用平均数（范围）表示。结果：（1）手术及术后恢复情况：254例患者中，112例行ESD，其中111例顺利完成手术，1例因术中出血量大，操作视野模糊，中转行开腹手术治疗； 93例成功行腹腔镜胃间质瘤楔形切除术；49例成功行开腹胃间质瘤楔形切除术。行ESD患者手术时间、术中出血量、术后首次进食流质食物时间、术后住院时间、住院费用分别为（75±21）min、（6.9±0.5）mL、（2.8±0.9）d、（5.5±0.2）d、（22 167±1 364）元，患者均未出现术后穿孔， 2例患者术后可触及皮下气肿，未予特殊处理，2 d后自行消散；行腹腔镜手术患者上述指标分别为（137±65）min、（48.1±2.6）mL、（3.9±1.4）d、（8.3±2.2）d、（32 937±1 823）元，术后均未出现并发症；行开腹手术患者上述指标分别为（168± 60）min、（157.2±10.3）mL、（5.8±1.7）d、（11.3±3.5）d、（38 462±1 961）元，术后均未出现并发症。（2）术后病理学检查情况：254例患者中，行ESD、腹腔镜和开腹手术患者的肿瘤直径分别为（2.6±1.6）cm、（6.1±2.2）cm、（6.4±2.3）cm。行ESD患者中，CD117阳性106例，功能未知蛋白（DOG1）阳性105例，CD34阳性86例，平滑肌肌动蛋白（SMA）阳性17例；行腹腔镜手术患者中，CD117阳性89例，DOG1阳性87例，CD34阳性59例，SMA阳性11例；行开腹手术患者中，CD117阳性46例，DOG1阳性47例，CD34阳性30例，SMA阳性8例。行ESD患者胃间质瘤极低危险度、低危险度、中等危险度和高危险度分别为67、42、3、0例，行腹腔镜手术患者分别为16、36、23、18例，行开腹手术患者分别为7、20、14、8例。（3）随访和生存情况：254例患者中，210例获得术后随访，其中行ESD 86例、腹腔镜手术82例、开腹手术42例，随访时间为6.0～ 120.0个月，平均随访时间为36.0个月。随访期间，行ESD患者中，3例中等危险度患者予以伊马替尼分别治疗7.0个月（目前仍在服药）、1.5年、2.0年，术后每6个月复查胃镜，均未发现肿瘤复发；81例极低危险度及低危险度患者术后每6个月复查胃镜，未予靶向治疗，均未发现肿瘤复发；2例死于非间质瘤疾病。行腹腔镜手术患者平均术后生存时间为56.3个月，术后1、3、5年生存率分别为98.8%（81/82）、91.5%（75/82）和74.4%（61/82）；行开腹手术患者平均术后生存时间为52.4个月，术后1、3、5年生存率分别为97.6%（41/42）、85.7%（36/42）和81.0%（34/42）。结论：根据患者具体情况行内镜、腹腔镜及开腹手术治疗胃间质瘤均安全可行。适当选择肿瘤直径较小患者行ESD安全有效，住院费用较少，长期预后较好。

关键词：胃肿瘤间质瘤内镜黏膜下切除术外科手术开腹手术腹腔镜检查

TRADD慢病毒载体构建及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

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第三军医大学学报 2012年第9期34卷 848-851页

作者：袁月康秀峰牟东薛世祥代剑华彭贵勇第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Pur... 详细信息

目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组。重组质粒转化DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒。Real-time定量PCR法检测病毒滴度。Western blot检测TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达。MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。结果菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致。包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖。结论成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

关键词： TRADD 慢病毒表达载体食管再狭窄基因治疗

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10137例胃息肉的临床及病理特征分析

第三军医大学学报 2018年第3期40卷 248-254页

作者：何金龙陈磊代剑华张昊翔冯吉魏周玲房殿春陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军消化病研究所重庆400038

目的分析重庆地区胃息肉的临床及病理特征。方法回顾性分析西南医院消化内镜中心数据库2007年1月至2016年12月检出的10 137例胃息肉患者的内镜报告及临床资料。结果10年间胃息肉的病理谱发生了显著的变化,增生性息肉所占比例由66.39%下... 详细信息

目的分析重庆地区胃息肉的临床及病理特征。方法回顾性分析西南医院消化内镜中心数据库2007年1月至2016年12月检出的10 137例胃息肉患者的内镜报告及临床资料。结果10年间胃息肉的病理谱发生了显著的变化,增生性息肉所占比例由66.39%下降到43.05%(P70岁组的48.69%(P70岁组的6.28%(P<0.001);异型增生和HIN在60岁以上人群中发生率分别是不超过60岁人群的3.89倍和4.75倍(P<0.001)。反流性食管炎发生率在胃底腺组(6.86%)明显高于非胃底腺组(3.54%)(P<0.001);胃底腺息肉组中***感染率(28.48%)明显低于非胃底腺息肉组(45.30%)(P<0.001);异型增生发生率在腺瘤性、增生性和胃底腺息肉中分别为60.47%、0.53%和0.20%;HIN发生率在腺瘤性、增生性和胃底腺息肉中分别为47.67%、0.07%和0.03%。胃息肉的数量及位置分布在不同时间段、不同年龄组、不同病理类型间均存在差异。结论重庆地区10年间增生性胃息肉明显下降,几乎无恶变风险的胃底腺息肉已成为主要的病理类型;临床中是否有必要对所有胃息肉进行切除治疗,应结合息肉病理类型、临床特征及患者意愿后做出差异性的管理策略。

关键词：胃息肉幽门螺杆菌反流性食管炎

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504例胃息肉发生相关因素的调查研究

第三军医大学学报 2017年第22期39卷 2226-2231页

作者：何金龙陈磊代剑华张昊翔冯吉魏周玲房殿春第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的探讨胃息肉发生的相关因素,为更有针对性胃息肉的预防提供科学依据。方法收集2016年10月至2017年3月就诊于西南医院各科室的504例行胃镜检查并经病理学证实为胃息肉的患者,以同期健康体检和各科室就诊的504例行胃镜检查未发现胃息... 详细信息

目的探讨胃息肉发生的相关因素,为更有针对性胃息肉的预防提供科学依据。方法收集2016年10月至2017年3月就诊于西南医院各科室的504例行胃镜检查并经病理学证实为胃息肉的患者,以同期健康体检和各科室就诊的504例行胃镜检查未发现胃息肉者作为对照,使用统一设计的调查问卷进行相关因素调查。对调查各因素进行单因素分析,将筛选出有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归分析。结果单因素分析结果显示,质子泵抑制剂使用情况、***感染史、胃息肉家族史、吸烟、饮酒、喝茶、体育锻炼、进食速度、进食水果、心情状况、精神创伤史及工作生活压力可能与胃息肉发生相关。多因素Logistic回归分析结果显示,使用质子泵抑制剂、***感染史、胃息肉家族史、长期饮酒、进食速度较快、精神创伤史是胃息肉发生的危险因素,体育锻炼(≥1次/周)、进食水果(≥2次/周)为其保护因素。结论胃息肉的发生与多种因素相关,避免长时间使用质子泵抑制剂及长期饮酒、根除***感染、适当的体育锻炼与进食水果、保持乐观的心态和养成良好的饮食习惯可能会有效降低胃息肉的发生风险。

关键词：胃息肉相关因素病例对照 Logistic回归分析

谷氨酰胺联合维生素C对军事训练中暑及内毒素血症的预防作用及机制研究

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第三军医大学学报 2010年第23期32卷 2503-2506页

作者：牟东薛世祥代剑华赵海霞袁月彭贵勇第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的观察谷氨酰胺联合维生素C对中暑及肠源性内毒素血症的干预作用,初步探讨其作用机制。方法对48例在高热环境下进行军事训练的士兵按照区组随机化法分为预防组(24例)和对照组(24例),预防组士兵在常规口服补液的基础上加服谷氨酰胺联... 详细信息

目的观察谷氨酰胺联合维生素C对中暑及肠源性内毒素血症的干预作用,初步探讨其作用机制。方法对48例在高热环境下进行军事训练的士兵按照区组随机化法分为预防组(24例)和对照组(24例),预防组士兵在常规口服补液的基础上加服谷氨酰胺联合维生素C预防中暑,对照组采用相同的常规补液加服安慰剂。比较2组中暑发生率,训练前后氧化应激指标、血浆内毒素、十二指肠粘膜超微结构及十二指肠粘膜热休克蛋白70(HSP70)表达变化。结果药物预防组和对照组中暑的发生率分别为8.3%(2/24)和33.3%(8/24),差异具有统计学意义(P<0.01);药物预防组较对照组血清超氧化物歧化酶(SOD)水平升高,血清丙二醛(MDA)及血清内毒素降低,差异均有统计学意义(P<0.01);透射电镜观察药物预防组十二指肠粘膜微绒毛、细胞器、内质网基本正常,对照组十二指肠粘膜多数微绒毛紊乱,细胞器、内质网均有肿胀,免疫组化结果表明药物预防组HSP70表达较对照组明显升高。结论谷氨酰胺联合维生素C可为小肠修复提供能量来源,提高热休克蛋白对小肠粘膜的保护作用,同时减轻氧化应激反应,从而保护小肠的屏障功能,降低肠源性内毒素血症发生。可用于中暑的预防性治疗。

关键词：谷氨酰胺维生素C 中暑内毒素热休克蛋白