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黑曲霉N25植酸酶phyA基因玉米表达载体的构建

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黑曲霉N25植酸酶phyA基因玉米表达载体的构建

作者：于新芬四川农业大学

学位级别：硕士

以本课题组测定出的黑曲霉N25植酸酶phyA基因为目的基因(GenBank Accession ***218813)，从信号肽序列切割位点序列之后设计上游引物(设计一个XbaI酶切位点);在终止密码子处设计下游引物(设计一个KpnI酶切位点)。用高保真度的聚合酶进... 详细信息

以本课题组测定出的黑曲霉N25植酸酶phyA基因为目的基因(GenBank Accession ***218813)，从信号肽序列切割位点序列之后设计上游引物(设计一个XbaI酶切位点);在终止密码子处设计下游引物(设计一个KpnI酶切位点)。用高保真度的聚合酶进行扩增，得到了大小约1.4kb的单一条带产物，即为phyA表达片段。将该产物经XbaI和KpnI酶切处理后连接到含有胚乳特异性启动子(EGH5 promoter)的中间载体pBPC47的多克隆位点上，转化大肠杆菌JM109菌株，在含100μg/mL的Amp抗性的LB平板上筛选到了的阳性菌落。质粒酶切分析和PCR分析结果表明获得了pBPC47-phyA重组质粒，命名为pBA;采用EcoRI和HindIII内切酶从pBA质粒中酶切出启动子-phyA-终止子(EGH5-phyA-nos)片段，插入到玉米表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点，并转化大肠杆菌JM109菌株，用光生物素标记的phyA基因探针进行菌落原位杂交，在100μg/mL的Km抗性LB培养基上筛选到了阳性转化菌落，质粒酶切分析结果表明获得了pCAMBIA1300重组表达载体，命名为pCBA。pCBA重组表达载体的构建为phyA基因在玉米种子的高效表达奠定了基础。以胚乳特异性启动子构建植酸酶基因的玉米表达载体，以玉米种子作为植物生物反应器生产植酸酶在国内外尚属首次。在玉米种子中特异性生产植酸酶，符合未来饲料的营养要求，可为生产廉价、高效、方便的植酸酶提供新途径，便于植酸酶的推广使用，有重要的学术价值和应用前景。该重组质粒现已转化玉米愈伤组织，分化出的幼苗已移栽大田。

关键词：黑曲霉N25,植酸酶,phyA基因,植物生物反应器,pBPC47载体,pCAMBIA1300载体,植酸酶玉米

猪源致病性沙门氏菌四环素耐药基因tetC的PCR扩增及序列分析

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中国抗生素杂志 2004年第7期29卷 415-417,434页

作者：代敏王红宁吴琦李春于新芬四川农业大学动物科技学院

本研究对 16株猪致病性沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测 ,结果表明 ,沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性 ,耐药率达 10 0 %。对四环素耐药基因 tet C进行 PCR扩增 ,结果在 12株沙门氏菌的质粒上扩增出特异性产物 ,与药敏试... 详细信息

本研究对 16株猪致病性沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测 ,结果表明 ,沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性 ,耐药率达 10 0 %。对四环素耐药基因 tet C进行 PCR扩增 ,结果在 12株沙门氏菌的质粒上扩增出特异性产物 ,与药敏试验结果阳性符合率 75 % ,具有较高的检出率 ;序列分析结果表明 tet C的核苷酸同源率较高 ,达 97.7%～ 98.7% ,建立 tet C基因的 PCR检测技术 ,为沙门氏菌对四环素耐药性的分子流行病学监测提供了有效的途径。

关键词：沙门氏菌四环素耐药基因 tetC PCR 序列分析

尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征

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中华预防医学杂志 2009年第5期43卷 390-394页

作者：寇宇于新芬叶榕潘劲草崔峰乔传令杭州市疾病预防控制中心 310006 中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室

目的研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型的分子特征。方法采集杭州市自然种群库蚊，提取单蚊DNA基因组，采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR—restriction fragment length polymorphism，PCR—R... 详细信息

目的研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型的分子特征。方法采集杭州市自然种群库蚊，提取单蚊DNA基因组，采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR—restriction fragment length polymorphism，PCR—RFLP）方法进行抗性相关酯酶的基因分型。对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物，进一步选用Bfm I内切酶进行酶切，确定酯酶B2基因Estβ2纯合型及Estβ2杂合型。本次研究共提取207只单蚊DNA，156份PCR样本阳性，阳性率75．36％（156／207）。结果在156份PCR样本阳性，酯酶B2基因Estβ2型占28．20％（44／156）；对该基因型进一步分型，其中Estβ2纯合型占90．90％（30／33），Estβ2杂合型占9％（3／33）；Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合（Estβ2／Estβ2’）形式存在。结论建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法，研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型。

关键词：库蚊属免疫表型分型表达的序列标记内切核酸酶类

杭州地区2009-2014年间人博卡病毒Ⅰ型的全基因组序列测定及遗传进化分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第6期35卷 401-406页

作者：周银燕李钧于新芬寇宇钱昕杭州市疾病预防控制中心 310021

目的调查杭州地区2009--2014年问人博卡病毒1型（humanbocavirus1，HBoV1）全基因组序列的遗传变异和分子进化特征。方法采集2009--2014年间浙江大学医学院附属儿童医院急性呼吸道感染患儿咽拭子标本，采用实时荧光PCR检测HBoV1，最终挑... 详细信息

目的调查杭州地区2009--2014年问人博卡病毒1型（humanbocavirus1，HBoV1）全基因组序列的遗传变异和分子进化特征。方法采集2009--2014年间浙江大学医学院附属儿童医院急性呼吸道感染患儿咽拭子标本，采用实时荧光PCR检测HBoV1，最终挑选15株病毒载量高的阳性样本进行全基因组扩增和测序。测序结果上传至GenBank，利用生物信息学软件分析序列。结果15株HBoV1病毒全基因组序列共检测到48个核苷酸突变，最终导致11个氨基酸变化，其中5个位点处于磷脂酶（PLA2）活性区。基于全基因组编码序列的进化分析表明HBoV1可以分为3个分支，本研究的15株病毒全部属于分支1，与瑞典代表株ST2属于同一簇。另外，进化树构建结果表明VP1／VP2基因可以替代全基因编码序列来构建HBoV1的进化树。HBoV1全基因组序列的进化速率为每年3．03×10-4（95％HPD，2．14×10-4～3．92×10-4）突变点／位点，对于单个基因，NS1的进化速率最慢，而NP1的进化速率最快。HBoV1四个基因的选择压力ω值部小于1，表明所有基因都处于纯化选择下，其中VP2的纯化选择压力最强，而NP1的纯化选择压力最弱。结论杭州地区2009—2014年间流行的HBoV1均属于ST2基因型，PLA2活性区变异率相对较高。全基因组序列虽然保守，但进化速率很快，其中NP1基因进化速率最快。4个基因均处于纯化选择压力下，其中VP2基因的纯化选择压力最强。

关键词：人博卡病毒呼吸道感染全基因组分子进化

临床细菌与H3N2流感病毒共感染特征及病毒血凝素裂解位点的变异研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第5期40卷 359-364页

作者：于新芬李钧钱昕寇宇潘劲草杭州市疾病预防控制中心微生物检验科 310021

目的了解流感样病例中临床细菌与H3N2流感病毒共感染及病毒血凝素(HA)裂解位点的变异特征。方法收集2013年1月至2018年12月的流感样病例样本12250份,实时荧光PCR检测H3N2流感病毒。选取部分流感阳性病例样本,采用实时荧光PCR的方法进行... 详细信息

目的了解流感样病例中临床细菌与H3N2流感病毒共感染及病毒血凝素(HA)裂解位点的变异特征。方法收集2013年1月至2018年12月的流感样病例样本12250份,实时荧光PCR检测H3N2流感病毒。选取部分流感阳性病例样本,采用实时荧光PCR的方法进行金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和B型流感嗜血杆菌的检测,分析其临床感染特征。分离流感病毒,RT-PCR扩增病毒HA,测序,构建进化树,并分析裂解位点氨基酸变异特征。结果2013年以来,每年都有H3N2流感病毒的流行,H3N2在流感阳性病例中的占比为44.69%。随机选取2013—2018年间流感流行高峰的H3N2阳性病例样本295份,29.2%的病例存在临床细菌感染。对分离到的210株H3N2流感病毒进行HA裂解位点测序,68株存在变异,其中63株为K342R单氨基酸位点变异,裂解位点由PEKQTR转变为PERQTR。裂解位点未变异样本的细菌共感染率为31.25%(45/144),裂解位点变异样本的细菌感染率为23.53%(16/68),二者的差异没有统计学意义(χ2=1.34,P>0.05)。杭州地区流行的H3N2流感病毒主要属于3C.3a和3C.2a两个进化簇,裂解位点发生K342R变异的病毒属于3C.3a进化簇。结论H3N2流感病毒在杭州地区的流感病毒流行中占据重要地位。流感阳性病例存在着一定程度的细菌共感染。裂解位点变异具有一定的地域流行特征,但与细菌共感染没有显著相关性。

关键词： H3N2型流感病毒细菌共感染 HA裂解位点变异

杭州地区2014—2019年乙型流感病毒HA和NA基因遗传进化分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第7期40卷 523-529页

作者：钱昕于新芬李钧周银燕文艳苹杭州市疾病预防控制中心卫生检验中心 310021

目的研究2014—2019年杭州地区乙型流感病毒的流行情况以及血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的遗传进化特征。方法收集2014年10月—2019年9月间杭州地区流感样病例10481例,用实时RT-PCR法检测乙型流感病毒,同时选取部分乙型流感病毒... 详细信息

目的研究2014—2019年杭州地区乙型流感病毒的流行情况以及血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的遗传进化特征。方法收集2014年10月—2019年9月间杭州地区流感样病例10481例,用实时RT-PCR法检测乙型流感病毒,同时选取部分乙型流感病毒阳性样本,用特异性引物扩增HA和NA基因,进行基因测序并分析其遗传进化特征。结果发现自2014年以来,杭州地区每年都有乙型流感病毒的流行。其中5~14岁年龄段人群发病率最高。2014—2019年,杭州地区流行的Victoria系乙型流感病毒都属于V1A进化簇,而Yamagata系乙型流感病毒都属于Y3进化簇。HA和NA基因的序列一致性分别为94.67%~100.00%和97.13%~100.00%,并在多个抗原位点发生了改变,同时出现了重排株。结论乙型流感病毒在杭州地区流感流行中影响显著。2014—2019年,杭州地区乙型流感病毒出现了抗原变异和基因重排,流行株和疫苗株之间存在不匹配的情况,但目前并未发现耐药株的出现和流行。

关键词：乙型流感病毒血凝素神经氨酸酶遗传进化

杭州市急性呼吸道感染婴幼儿中副流感病毒3型遗传进化及其感染特征研究

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中华预防医学杂志 2016年第3期50卷 255-260页

作者：钱昕于新芬赵敏寇宇李钧周银燕杭州市疾病预防控制中心微生物检验科 310021 杭州市儿童医院监察室

目的分析杭州市婴幼儿中副流感病毒3型（HPIV-3）的遗传进化及其感染与合并感染情况。方法收集2009年12月至2013年3月杭州地区医院0—11岁婴幼儿急性呼吸道感染病例咽拭子或呼吸道吸出物样本，共856份（男性553例，女性303例）。采用逆... 详细信息

目的分析杭州市婴幼儿中副流感病毒3型（HPIV-3）的遗传进化及其感染与合并感染情况。方法收集2009年12月至2013年3月杭州地区医院0—11岁婴幼儿急性呼吸道感染病例咽拭子或呼吸道吸出物样本，共856份（男性553例，女性303例）。采用逆转录荧光定量PCR（***）法检测HPIV-3，阳性样本用特异性引物扩增HN基因进行基因测序，将测序所得序列用ClustalX2．0软件进行比对，然后使用MEGA6．0软件，采用邻接法建立系统进化树。同时，用qRT-PCR法检测与其他呼吸道病原体的合并感染情况。采用x2检验比较不同特征患儿单一感染与合并感染情况。结果856例患儿中，HPIV-3阳性84例（9．6％）。男性患儿HPIV-3感染阳性率为10．0％（55／553），女性患儿阳性率为9．6％（29／303）（x2=0．03，P=0．860）。84例HPIV．3阳性病例的合并感染率为49％（41例），其中与鼻病毒合并感染检出率较高，为41％（17例）；1岁以下患儿的合并感染率为54％（36／67），高于单一感染率【46％（31／67）]（X2=4．78，P=0．029）；单一感染患儿伴有肺炎症状占93％（37／40），高于合并感染组【76％（29／38）]（x2=3．92，P=0．048）。同源性分析结果显示，56例患儿HPIV．3的HN基因编码区核苷酸和氨基酸序列一致性均较高，一致性分别为96．9％～100．0％和98．6％．100％。基于HN基因的进化树分析表明，杭州株均归属于c3亚群。结论杭州市婴幼儿的急性呼吸道感染与HPIV-3有关；HPIV-3HN基因型变异较小，但进化具有一定地域特征；与其他呼吸道病毒的合并感染率较高。

关键词：副流感病毒3型人感染遗传

杭白菊总黄酮对铅诱导小鼠氧化损伤的拮抗效应研究

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中国中药杂志 2008年第23期33卷 2803-2808页

作者：夏道宗吕圭源于新芬王慧铭杨晴浙江中医药大学药学院浙江杭州310053 浙江中医药大学药物研究所浙江杭州310053 杭州市疾病预防控制中心浙江杭州310006

目的:探讨杭白菊总黄酮(total flavonoids from Chrysanthemum morifolium,TFCM)对铅诱导小鼠脑、肝脏和肾脏氧化损伤的拮抗效应。方法:将90只雄性小鼠分为9组:正常组,模型组,阳性药组,TFCM低、中、高(150,300,500 ***-1)剂量组,TFCM低... 详细信息

目的:探讨杭白菊总黄酮(total flavonoids from Chrysanthemum morifolium,TFCM)对铅诱导小鼠脑、肝脏和肾脏氧化损伤的拮抗效应。方法:将90只雄性小鼠分为9组:正常组,模型组,阳性药组,TFCM低、中、高(150,300,500 ***-1)剂量组,TFCM低、中、高剂量+二巯基丁二酸(DMSA,70 ***-1)组。前20 d,除正常组外,其余小鼠隔天腹腔注射醋酸铅建立铅中毒模型;接下来的10 d,各组小鼠灌胃给予受试物。实验结束后,摘眼球取血及各脏器,测定全血、脑、肝脏、肾脏中铅、锌和铜的含量,计算脏体比重系数,并对抗氧化酶活性及脂质过氧化水平进行检测和分析。结果:TFCM可拮抗铅中毒小鼠体重的下降和脏体比重的升高。单独使用TFCM对小鼠血液及组织中铅浓度并无显著影响,但与DMSA联合使用时排铅效果显著(P<0.01),且未造成锌、铜的流失。中、高剂量TFCM在增加小鼠脑GSH含量,GSH-Px,SOD,CAT活性及降低MDA含量方面,效果明显优于DMSA;高剂量TFCM在增加小鼠肝脏和肾脏GSH-Px,CAT活性及降低MDA含量方面,效果也明显优于DMSA。TFCM与DMSA联合使用时,也可显著改善小鼠脑、肝脏和肾脏脂质过氧化,增加GSH,GSH-Px,SOD和CAT的活性,效果优于单独使用DMSA。结论:TFCM可显著提高铅中毒小鼠组织中抗氧化酶的活性,改善脂质过氧化,从而明显拮抗铅诱导的脑、肝脏和肾脏氧化损伤。

关键词：杭白菊总黄酮铅中毒氧化损伤药物拮抗效应

麦冬总黄酮提取的响应面法优化及抗氧化性研究

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中华中医药杂志 2009年第12期24卷 1629-1632页

作者：夏道宗于新芬王慧铭蒋立勤夏明浙江中医药大学药学院杭州310053 杭州市疾病预防控制中心杭州310006

目的:探讨麦冬总黄酮(TFOJ)的提取工艺及其体内外抗氧化作用。方法:采用响应面法优化TFOJ的提取工艺;体外试验测定TFOJ、TFOJE和TFOJB清除自由基的能力;采用D-半乳糖建立小鼠氧化损伤模型,研究TFOJE和TFOJB对其的保护作用。结果:TFOJ的... 详细信息

目的:探讨麦冬总黄酮(TFOJ)的提取工艺及其体内外抗氧化作用。方法:采用响应面法优化TFOJ的提取工艺;体外试验测定TFOJ、TFOJE和TFOJB清除自由基的能力;采用D-半乳糖建立小鼠氧化损伤模型,研究TFOJE和TFOJB对其的保护作用。结果:TFOJ的最佳提取条件:提取时间188min,乙醇浓度73%,温度72℃,料液比1∶29,最高得率0.886%。TFOJ、TFOJE和TFOJB均可有效清除DPPH、ABTS+自由基。TFOJB的抗氧化效果较优,可使氧化损伤小鼠血清和肝脏中MDA含量分别下降17.2%、15.7%,GSH-Px、SOD活性分别增高36.5%、17.2%和34.2%、13.5%。结论:麦冬中黄酮类化合物具有良好的自由基清除能力,可显著改善小鼠氧化损伤。

关键词：麦冬黄酮类化合物响应面方法抗氧化