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鸡传染性法式囊病毒VP2蛋白B细胞抗原表位的研究

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鸡传染性法式囊病毒VP2蛋白B细胞抗原表位的研究

作者：乔宏兴河南农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触性传染病。病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖,损伤法氏囊的B淋巴细胞,引起严重的免疫抑制,从而导致疫苗免疫失败和继发感染的发... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触性传染病。病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖,损伤法氏囊的B淋巴细胞,引起严重的免疫抑制,从而导致疫苗免疫失败和继发感染的发生,对养鸡业造成严重的经济损失。IBDV属于双RNA病毒科的成员,病毒基因组由A,B两个片段的双股RNA组成。其中,基因组B片段编码病毒蛋白VP1,它是一种RNA依赖性的RNA聚合酶;基因组A片段包含2个部分重叠的开放阅读框架(ORF),小ORF编码分子量为17kDa的非结构蛋白VP5;大ORF编码一种分子量约110kDa的前体多聚蛋白,该蛋白在翻译后进一步加工形成VP2、VP3利VP4,形成IBDV的结构蛋白,参与病毒核衣壳的形成,携带病毒主要中和性B细胞抗原表位,诱导中和性抗体的产生。 B细胞抗原表位又称抗原决定簇,是抗原分子上能够被抗体分子识别的部位,在蛋白质抗原中一股由几个直接相邻或构象上相邻的氨基酸组成,决定着机体产生抗体的特异性,是诱导体液免疫的基本单位。对以体液免疫反应为主的IBDV来说,鉴定其B细胞抗原表位便是揭示IBD体液免疫的本质。本项研究应用基因工程技术构建了VP2基因原核表达载体pETVP2,并在大肠杆菌中诱导表达了鸡IBDV主要结构蛋白VP2。表达蛋白能够与鸡IBDV抗血清和单抗发生特异性反应,应用该表达蛋白鉴定出11株单克隆抗体识别VP2蛋白。在应用生物信息学原理分析鸡IBDV VP2蛋白结构特性的基础上,合成了VP2 16-mer重叠多肽51条,VP2 12-mer重叠多肽64条,合成多肽与载体蛋白BSA偶联后,经peptide-ELISA利Dot-ELISA检测其与鸡IBDV单克隆抗体和多抗的反应性。结果显示,VP2中含有5个中和性单克隆抗体识别的线性表位:EP1:37TLRSETSTYNLTV49;EP2:76SNGNYKF82;EP3:201DRPRVYTITAADDYQFS217;EP4:326SWSARGSLAVTI337;EP5:403SERDRLGIKTVW414和6个多抗反应位点:ES1:91NLPASYNYCRLVSRSLTV108;ES2:331GSLAVTIHGGNYPGALRPVTLV352;ES3:371FELIPNPELAKNLVTEYG388;ES4:433NSPLKIAGAFGFK445;ES5:449RAIRRIAVPVVS460;ES6:495ASGKARAASGRIRQLTLA512。VP2单克隆抗体识别的抗原表位多肽同时也能够与鸡IBDV多抗反应。通过重叠多肽合成技术和单克隆抗体抑制实验证明单克隆抗体YNW17识别VP2表位的氨基酸序列为:197CDSSDRPRVYTIT209;单克隆抗体YNW29识别表位的序列为:329ARGSLAVTI337。进一步精确定位了表位EP3和EP4的序列范围。通过本项研究,详细地绘制了鸡IBDV VP2蛋白的抗原表位图谱,对揭示IBDV体液免疫产生的本质具有重要意义,同时为设计IBD新型表位疫苗奠定了基础。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒中和性抗体 B细胞抗原表位多肽合成

猪圆环病毒2型H株cap基因原核表达载体的构建与表达

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畜牧与兽医 2008年第5期40卷 67-69页

作者：乔宏兴边传周郑州牧业工程高等专科学校河南郑州450011

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白(Cap)基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了表达载体pET-H2,转化至大肠杆菌BL21中,用ITPG诱导表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表... 详细信息

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白(Cap)基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了表达载体pET-H2,转化至大肠杆菌BL21中,用ITPG诱导表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达,与预期大小30 ku相符;Western-blotting分析表明,表达产物能与抗猪PCV2阳性血清发生反应。

关键词：猪圆环病毒 cap基因原核表达

猪圆环病毒2型Cap基因的原核表达及ELISA检测方法的建立

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中国免疫学杂志 2009年第12期25卷 1108-1111页

作者：乔宏兴边传周郑州牧业工程高等专科学校郑州450011

目的:方法:为建立PCV-2 ELISA检测方法。利用PCR技术从PCV-2基因组中克隆Cap抗原表位基因,并将其插入到载体pET-22b(+)中,构建成原核表达质粒pET-22b(+)-Cap,使其在***21(DE3)中以IPTG诱导表达并进行纯化,以表达的蛋白进行包被,建立ELIS... 详细信息

目的:方法:为建立PCV-2 ELISA检测方法。利用PCR技术从PCV-2基因组中克隆Cap抗原表位基因,并将其插入到载体pET-22b(+)中,构建成原核表达质粒pET-22b(+)-Cap,使其在***21(DE3)中以IPTG诱导表达并进行纯化,以表达的蛋白进行包被,建立ELISA检测方法。结果:表达产物分子质量约30 kD,经Western blot表明具有良好的免疫活性,对643份猪血清进行检测,阳性率为73.1%,阴性率为26.9%。结论:该检测方法能在临床中进行应用。

关键词：猪圆环病毒原核表达 ELISA

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

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中国兽医科学 2006年第5期36卷 376-380页

作者：边传周乔宏兴郑州牧业工程高等专科学校河南郑州450011

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表... 详细信息

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强(+++);与4E4、1H11反应中度(++);与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。

关键词：传染性腔上囊病病毒 VP2基因原核表达复性

一株副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及血清平板凝集试验的建立

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黑龙江畜牧兽医（下半月） 2015年第3期 83-85页

作者：乔宏兴边传周任敏河南牧业经济学院郑州450011

传染性鼻炎（infectious coryza,IC）是由副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum,Hpg）引起鸡的一种急性呼吸道疾病,鼻腔、窦黏膜及眼结膜发炎,以流涕、喷嚏、流泪及眶下窦肿胀、脸部水肿为特征[1]。该病的发病率可达20%~50%,死亡... 详细信息

传染性鼻炎（infectious coryza,IC）是由副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum,Hpg）引起鸡的一种急性呼吸道疾病,鼻腔、窦黏膜及眼结膜发炎,以流涕、喷嚏、流泪及眶下窦肿胀、脸部水肿为特征[1]。该病的发病率可达20%~50%,死亡率可达5%~20%。传染性鼻炎造成的最大损失是育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋明显下降（10%~40%）,而且对鸡群中发生时，由于其他病原和应激因素的存在，造成相关的经济损失更大。

关键词：副鸡嗜血杆菌平板凝集试验传染性鼻炎急性呼吸道疾病 Haemophilus 眼结膜发炎眶下窦最大损失育成鸡 infectious

益生菌和绞股蓝联合使用对肉仔鸡生产性能的影响

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中国畜牧杂志 2012年第21期48卷 61-64页

作者：宁豫昌乔宏兴郑鸣马辉郑州牧业工程高等专科学校河南郑州450011

为探讨益生菌与绞股蓝联合使用在肉仔鸡生产中的协同作用效果,将乳杆菌微胶囊、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌粉和中草药绞股蓝按一定比例混合复配成益生菌-绞股蓝复合微生态制剂;在1日龄AA肉仔鸡基础日粮中分别添加1 g/kg的益生菌制... 详细信息

为探讨益生菌与绞股蓝联合使用在肉仔鸡生产中的协同作用效果,将乳杆菌微胶囊、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌粉和中草药绞股蓝按一定比例混合复配成益生菌-绞股蓝复合微生态制剂;在1日龄AA肉仔鸡基础日粮中分别添加1 g/kg的益生菌制剂、5 g/kg的中草药绞股蓝粉剂和6 g/kg的益生菌-绞股蓝复合微生态制剂,对肉仔鸡生长性能、免疫器官指数、新城疫抗体效价和肠道菌群变化进行分析。结果表明:益生菌-绞股蓝复合微生态制剂组与益生菌组、绞股蓝组相比,可以显著提高肉仔鸡生产性能,在整个试验期增重分别提高了1.45%和6.73%;饲料增重比分别下降了5.45%和9.05%;显著促进机体免疫器官发育,在整个试验期法氏囊指数分别提高26.14%和32.19%;脾脏指数分别提高32.84%和45.6%;显著提高鸡新城疫抗体效价(P<0.05),明显改善肉仔鸡肠道菌群平衡(P<0.05)。说明益生菌和绞股蓝联合使用对于提高肉仔鸡生产性能、增强机体免疫力和改善肠道微生态平衡等方面均具有较好协同作用。

关键词：益生菌绞股蓝复合微生态制剂肉仔鸡

胶体金免疫层析法检测猪圆环病毒2型Cap抗体方法的建立及应用

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中国兽医杂志 2007年第8期43卷 23-25页

作者：王慧杰乔宏兴郑州牧业工程高等专科学校河南郑州450011

断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)自1991年报道[1,2]以来,相继在北美、欧洲、亚洲许多国家暴发和蔓延[3],后经研究证实猪圆环病毒2型(PCV-2)是PMWS的主要病原[4],有PCV-1和PCV-2两种基因型,PCV-1不具有致病性,但在正常血清中广泛存在[5].PCV-2病毒基因组全长为1 767或1 768 bp,主要包含ORF1、ORF2两个阅读框。[第一段]

关键词：猪圆环病毒2型胶体金免疫层析法抗体方法断奶仔猪多系统衰竭综合征 Cap 应用检测 PCV-2

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屎肠球菌冷冻干燥保护剂的组成优化

中国饲料 2015年第18期 14-16页

作者：索江华杨森乔宏兴河南牧业经济学院生物工程系河南郑州450046 河南农业大学生命科学学院河南郑州450046

屎肠球菌在微生态产品中的应用效果受产品活菌量、贮存稳定性影响明显。为寻找适于屎肠球菌规模化生产的冻干保护剂,根据现有的乳酸菌冻干保护剂在乳酸菌冻干保存过程中的作用机理对乳酸菌冻干保护剂进行研究,运用单因素试验和正交试验... 详细信息

屎肠球菌在微生态产品中的应用效果受产品活菌量、贮存稳定性影响明显。为寻找适于屎肠球菌规模化生产的冻干保护剂,根据现有的乳酸菌冻干保护剂在乳酸菌冻干保存过程中的作用机理对乳酸菌冻干保护剂进行研究,运用单因素试验和正交试验优化冻干保护剂的配比。最终得到屎肠球菌冻干保护剂优化配比为:甘油1.5%、脱脂乳12%、蔗糖3%,乳酸菌冻干后的存活率最高为93%,实现了屎肠球菌冻干制剂的含菌量和菌体活力最大程度的保留。

关键词：乳酸菌冻干保藏脱脂乳甘油蔗糖