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TAT-EGFP融合蛋白的表达、纯化及穿膜活性研究

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TAT-EGFP融合蛋白的表达、纯化及穿膜活性研究

作者：万彦彬广西医科大学

学位级别：硕士

目的:构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,诱导TAT-EGFP蛋白的表达,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用,对TAT-EGFP促进三氧化二砷(AsO)进入EJ细胞膜发挥抗肿瘤的作用进行... 详细信息

目的:构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,诱导TAT-EGFP蛋白的表达,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用,对TAT-EGFP促进三氧化二砷(AsO)进入EJ细胞膜发挥抗肿瘤的作用进行观察,为后续构建TAT-肿瘤特异性抗体-AsO新型偶联药物传送体统奠定基础。方法:以PEGP-1为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物连入pET30a载体,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达TAT-EGFP融合蛋白。经超声法裂菌处理,所得含TAT-EGFP蛋白菌液用pET30a表达系统相应的Ni-NTA His Resin纯化系统进行纯化,得到纯化的TAT-EGFP融合蛋白。该蛋白经纯化后分别与膀胱瘤细胞(EJ)和膀胱癌组织共孵育,用荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况。将纯化蛋白、三氧化二砷(AsO)与EJ细胞共孵育,用原子荧光光度计检测EJ细胞中砷浓度,MTT法检测EJ细胞的生长抑制率,对TAT-EGFP融合蛋白促进AsO杀伤EJ细胞的功能进行观察。结果:测序证实扩增的TAT-EGFP基因与预期序列一致,重组质粒pET30a-TAT-EGFP构建成功。TAT-EGFP融合蛋白原核表达系统所表达的TAT-EGFP纯度达90 %左右,浓度为1.24mg/ml。TAT-EGFP融合蛋白能穿入EJ细胞和膀胱癌组织,穿细胞效率与浓度和时间相关;TAT-EGFP可促进AsO对EJ细胞的杀伤作用,增加细胞抑制率。结论:成功构建了重组表达质粒pET30a-TAT-EGFP,纯化的融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用,TAT-EGFP融合蛋白可提高AsO进入人膀胱癌(EJ)细胞的浓度并显著促进AsO对EJ细胞活性的抑制作用。

关键词：穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白穿膜作用递送三氧化二砷

Toll样受体2和Toll样受体4在HBV感染后的免疫作用

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国际免疫学杂志 2009年第1期32卷 51-54页

作者：万彦彬冷静广西医科大学微生物免疫教研室南宁530021

Toll样受体（TLR）是启动固有免疫和调节适应性免疫的重要分子，参与肝脏对病毒及细菌的免疫TLR2、TLR4过程。在HBV的慢性化进程中，TLR2、TLR4与Thl和Th2的免疫平衡及调节性T细胞（Treg）的免疫抑制相关，HBV感染后，HBcAg刺激巨噬细... 详细信息

Toll样受体（TLR）是启动固有免疫和调节适应性免疫的重要分子，参与肝脏对病毒及细菌的免疫TLR2、TLR4过程。在HBV的慢性化进程中，TLR2、TLR4与Thl和Th2的免疫平衡及调节性T细胞（Treg）的免疫抑制相关，HBV感染后，HBcAg刺激巨噬细胞产生TNF—α的作用需要TLR2参与，HBeAg的表达与否与TLR2的表达状态有关，而TLR4通过诱导iNOS的表达和激发HBV特异性免疫在体内抗HBV过程中起重要作用：

关键词： Toll样受体乙型肝炎病毒 Th1或Th2 Toll样受体2 Toll样受体4

糖化血红蛋白、血脂及超敏C反应蛋白检测在冠心病中的临床意义

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国际检验医学杂志 2010年第7期31卷 738-739页

作者：万彦彬深圳市龙岗区人民医院检验科 518172

目的检测冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称"冠心病")患者血清糖化血红蛋白(HbAlc)、血脂(血清总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白)及超敏C反应蛋白(hs-CRP)的水平,探讨其临床意义。方法选取该院确诊的152例冠心病患者作为观... 详细信息

目的检测冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称"冠心病")患者血清糖化血红蛋白(HbAlc)、血脂(血清总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白)及超敏C反应蛋白(hs-CRP)的水平,探讨其临床意义。方法选取该院确诊的152例冠心病患者作为观察组,50例健康体检成人作为健康对照组,检测血清中HbAlc、血脂及hs-CRP的含量。结果观察组HbAlc、血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白及hs-CRP的水平显著高于健康对照组,高密度脂蛋白的水平显著低于健康对照组。HbAlc、血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白及hs-CRP的水平随着冠心病病变分支的增加而水平增加,而高密度脂蛋白水平随着病变分支的增加而下降。结论 HbAlc、血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白及hs-CRP的高水平有促进冠心病发展的可能,高密度脂蛋白高水平可能延缓冠心病的发展。

关键词：冠状动脉疾病 C反应蛋白质血脂异常血红蛋白A,糖基化

穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定

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基础医学与临床 2010年第9期30卷 902-906页

作者：周洁郭晓云冷静万彦彬广西医科大学第一附属医院泌尿外科广西南宁530021 广西医科大学第一附属医院消化内科广西南宁530021 广西医科大学第一附属医院免疫学教研室广西南宁530021

目的构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白。方法通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达... 详细信息

目的构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白。方法通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达蛋白后过层析柱纯化,蛋白电泳检测表达蛋白分子质量,蛋白飞行质谱分析检测蛋白序列,体外细胞实验验证其穿膜功能。结果电泳检测可见与CPPs-EGFP分子质量对应的电泳条带,构建质粒测序含有目的基因序列。蛋白电泳检测到纯度较高的融合蛋白,其蛋白序列与目的序列一致。体外细胞实验证实了融合蛋白的穿膜功能。结论成功制备了具有穿膜功能的CPPs-EGFP融合蛋白,为其促进抗体-蛋白微球偶联物进入肿瘤细胞发挥治疗作用的研究奠定了基础。

关键词：穿膜肽增强型绿色荧光蛋白膀胱肿瘤

结直肠癌患者血清中MMP-2、MMP-9和MMP-14检测的临床意义

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右江医学 2010年第2期38卷 131-133页

作者：万彦彬广东省深圳市龙岗区人民医院检验科广东深圳518712

目的探讨MMP-2、MMP-9及MMP-14在结直肠癌患者血清中的表达水平,并分析其与结直肠癌分化程度、Dukes分期及淋巴结转移等病理参数的关系,以更好的指导临床工作。方法应用ELISA(酶联免疫吸附实验)分别检测200例结直肠癌患者(观察组)、60... 详细信息

目的探讨MMP-2、MMP-9及MMP-14在结直肠癌患者血清中的表达水平,并分析其与结直肠癌分化程度、Dukes分期及淋巴结转移等病理参数的关系,以更好的指导临床工作。方法应用ELISA(酶联免疫吸附实验)分别检测200例结直肠癌患者(观察组)、60例健康成人(对照组)血清中MMP-2、MMP-9和MMP-14的含量。结果观察组血清中MMP-2、MMP-9及MMP-14表达量显著高于对照组(P<0.01),观察组中不同临床特征患者血清MMP-2、MMP-9和MMP-14的表达与肿瘤分化程度、Dukes分期以及淋巴结转移有关(P<0.01),经相关性分析,MMP-2和MMP-9、MMP-9和MMP-14的表达呈正相关(P均<0.05)。结论MMP-2、MMP-9和MMP-14在结直肠癌患者血清中高表达,三者可能在结直肠癌发生发展中起重要作用;早期联合检测MMP-2、MMP-9和MMP-14可能对判断患者的预后及指导临床治疗有重要价值。

关键词：结直肠癌 MMP-2 MMP-9 MMP-14

急性胰腺炎患者血浆PTX3水平与早期炎症反应及病情严重程度的关系

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山东医药 2016年第22期56卷 85-86页

作者：林建姣刘艳胡红松万彦彬李展汉罗保华深圳市龙岗区人民医院广东深圳518172

目的探讨急性胰腺炎(AP)患者血浆正五聚蛋白3(PTX-3)水平与早期炎症反应及严重程度的关系。方法选择AP患者62例,其中轻度32例(MAP组)、中度18例(MSAP组)、重度12例(SAP组)。另择同期健康体检者25例作为对照组。检测血浆PTX3及炎性因子I... 详细信息

目的探讨急性胰腺炎(AP)患者血浆正五聚蛋白3(PTX-3)水平与早期炎症反应及严重程度的关系。方法选择AP患者62例,其中轻度32例(MAP组)、中度18例(MSAP组)、重度12例(SAP组)。另择同期健康体检者25例作为对照组。检测血浆PTX3及炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α,采用APACHEⅡ评分、Ranson评分评估病情严重程度,Pearson相关分析血浆PTX3与炎性因子、APACHEⅡ评分、Ranson评分的相关性。结果 AP患者入院时血浆PTX3均高于对照组;以SAP组最高,MSAP组次之,MAP组最低(P均<0.01)。SAP组血浆IL-6、IL-8、TNF-α及APACHEⅡ评分、Ranson评分均高于MSAP组和MAP组,MSAP组高于MAP组(P均<0.01)。血浆PTX3与IL-6、IL-8、TNF-α及APACHEⅡ评分、Ranson评分均呈显著正相关(r分别为0.726、0.908、0.899、0.780、0.620,P均<0.05)。结论血浆PTX3在AP患者早期炎症程度、病情严重程度评估方面具有一定的应用价值,有可能成为SAP早期诊断和预后判断的指标之一。

关键词：正五聚蛋白3 急性胰腺炎炎症反应 APACHEⅡ评分 Ranson评分

三氯乙烯药疹样皮炎患者血清微量元素含量及肝代谢酶基因表达水平的测定

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中国皮肤性病学杂志 2014年第12期28卷 1233-1235,1266页

作者：隆岚刘国红万彦彬深圳市龙岗区人民医院皮肤科广东深圳518172 深圳市疾病预防控制中心广东深圳518055 深圳市龙岗区人民医院检验科广东深圳518172

目的探讨三氯乙烯(TCE)药疹样皮炎患者血中微量元素和肝代谢酶基因表达水平改变。方法采用全自动生化分析仪测定病例组和对照组血清中Ca,Mg,Fe和P等微量元素含量。采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术检测外周血中CYP1... 详细信息

目的探讨三氯乙烯(TCE)药疹样皮炎患者血中微量元素和肝代谢酶基因表达水平改变。方法采用全自动生化分析仪测定病例组和对照组血清中Ca,Mg,Fe和P等微量元素含量。采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术检测外周血中CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4和CYP2C9 mRNA表达水平。结果 TCE皮炎患者血清Ca水平下降明显,治疗后有所提高,差异有统计学意义(P0.05)。TCE皮炎患者外周血肝代谢酶CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4和CYP2C9 mRNA表达水平均提高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论三氯乙烯可导致体内微量元素含量变动和肝代谢酶基因表达水平改变,提示某些微量元素和肝代谢酶基因可能参与TCE的毒性代谢机制。

关键词：三氯乙烯药疹样皮炎微量元素肝代谢酶基因实时荧光定量PCR

用PCR-限制性长度多态性鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌

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实用预防医学 2010年第5期17卷 879-882页

作者：万彦彬广东省深圳市龙岗区人民医院广东深圳518172

目的通过PCR和限制性长度多态性分析,建立鉴定分枝杆菌的PCR-限制性长度多态性分析方法 ,为早期诊断结核分枝杆菌(MTB)与非结核分枝杆菌(NTM)病提供新的工具。方法设计分枝杆菌属特异性通用引物,用MspⅠ对PCR产物进行限制性酶切,对酶切... 详细信息

目的通过PCR和限制性长度多态性分析,建立鉴定分枝杆菌的PCR-限制性长度多态性分析方法 ,为早期诊断结核分枝杆菌(MTB)与非结核分枝杆菌(NTM)病提供新的工具。方法设计分枝杆菌属特异性通用引物,用MspⅠ对PCR产物进行限制性酶切,对酶切结果进行聚类分析,建立鉴定分枝杆菌的PRA方法。结果本实验所设计的一对引物具有良好的通用性和特异性,PRA法鉴定98株分枝杆菌的结果与传统鉴定法完全一致,其灵敏度、特异度和准确度均为100%,方法学评价指标结果达到诊断性实验的要求。结论 PRA法快速灵敏,可直接检测标本中的分枝杆菌而无需培养增菌,其成本低廉、结果准确,不会因耐药突变而影响结果判断。

关键词：结核分枝杆菌非结核分枝杆菌分枝杆菌限制性片段长度多态性

平均血小板容积、纤维蛋白原含量及血液流变学在青年脑梗死患者外周血中的变化

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中国实验血液学杂志 2012年第2期20卷 390-393页

作者：唐万兵李梅笑李观强蔡洁丹韦深万彦彬广东省深圳市龙岗区人民医院检验科广东深圳518172 广东省深圳市龙岗区人民医院神经内科广东深圳518172

本研究旨在探讨平均血小板容积(MPV)、纤维蛋白原(FIB)含量及血液流变学改变与青年脑梗死患者梗死体积的相关性,为其临床早期诊断和治疗提供依据。根据头部CT或MRI病灶大小及神经功能受损程度将我院109例脑梗死患者(18-45岁)分为大梗死... 详细信息

本研究旨在探讨平均血小板容积(MPV)、纤维蛋白原(FIB)含量及血液流变学改变与青年脑梗死患者梗死体积的相关性,为其临床早期诊断和治疗提供依据。根据头部CT或MRI病灶大小及神经功能受损程度将我院109例脑梗死患者(18-45岁)分为大梗死组(梗死体积>10 cm3)、中梗死组(梗死体积4-10 cm3)、小梗死组(梗死体积<4 cm3),30例健康查体正常人作为对照组,进行MPV、FIB及血液流变学指标检查,包括:全血黏度低切(Lηb)、全血黏度中切(Mηb)、全血黏度高切(Hηb)、血浆黏度值(ηP)、全血还原黏度低切(Lηr)、全血还原黏度中切(Mηr)、全血还原黏度高切(Hηr)、血沉方程K值(KVE)、红细胞积聚指数(EAI)、红细胞刚性指数(ERI)、红细胞变形指数(EDI)、红细胞电泳指数(EEI)、红细胞比容、血沉,共计16项指标。结果表明:各组脑梗死患者MPV、FIB含量和血液流变学指标均高于健康对照组(P<0.05);大梗死组MPV、FIB含量和血液流变学指标均高于小梗死组(P<0.05);各组脑梗死患者在病程恢复期MPV、FIB含量和血液流变学指标均有明显下降,但未达到健康对照组水平(P<0.05)。脑梗死体积与MPV、FIB含量及血液流变学水平呈正相关(r=0.36,0.29,0.48)。结论:青年脑梗死病情的严重程度与MPV、FIB及血液流变学水平密切相关,定期检查上述指标对预防青年脑梗死很有价值。

关键词：脑梗死血小板容积纤维蛋白原血液流变学