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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的克隆与原核表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的克隆与原核表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：何晓明张冠群马静云谢青梅陈峰毕英佐华南农业大学动物科学学院基因工程实验室

根据由本实验室分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD1株的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法从已构建的pMD19-GD1-pORF7重组质粒中扩增ORF7片段。获得372bp的DNA片段。将ORF7基因克隆入原核表达载体pBCX中,转化到B... 详细信息

根据由本实验室分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD1株的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法从已构建的pMD19-GD1-pORF7重组质粒中扩增ORF7片段。获得372bp的DNA片段。将ORF7基因克隆入原核表达载体pBCX中,转化到BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达获得大小为44kD融合蛋白,经Western blot分析表明,表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应。表明成功表达出N蛋白,为PRRSV新型诊断试剂的研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白克隆原核表达

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猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：孙东波冯力刘杰时洪艳佟有恩刘胜旺童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨维科生物技术开发公司中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

以猪传染性胃肠炎病毒标准华毒株H的n基因重组质粒pMD1-TN为模板,通过PCR扩增出1149bp大小的n基因,然后将其亚克隆到pET-30a原核表达载体,成功地构建了TGEVn基因的原核表达载体pET30a-N,重组质粒转化***21感受态细胞,用IPTG进行诱导表达... 详细信息

以猪传染性胃肠炎病毒标准华毒株H的n基因重组质粒pMD1-TN为模板,通过PCR扩增出1149bp大小的n基因,然后将其亚克隆到pET-30a原核表达载体,成功地构建了TGEVn基因的原核表达载体pET30a-N,重组质粒转化***21感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,经SDS2PAGE分析表明TGEVN蛋白在大肠杆菌中获得了融合表达。通过Western blot试验检测表明:重组N蛋白与TGEV阳性血清具有很强反应性重组N蛋白的高免血清能够识别TGEV的N蛋白,说明利用大肠杆菌表达的TGEV N蛋白具有良好的免疫活性。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 n基因原核表达免疫活性分析

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云南省红河州猪衣原体性繁殖障碍的病原分离鉴定

云南省红河州猪衣原体性繁殖障碍的病原分离鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：王琼秋云南省红河州动物疫病预防控制中心

从云南省红河州猪繁殖障碍较为严重的部分地区大批死亡的新生仔猪和流产胎儿的内脏中分离到2株衣原体。将分离株鸡胚卵黄囊膜悬液接种7日龄鸡胚能导致鸡胚规律性死亡;该分离株对磺胺嘧啶(SD)具有抵抗力;碘染色阴性;补体结合试验阳性;对... 详细信息

从云南省红河州猪繁殖障碍较为严重的部分地区大批死亡的新生仔猪和流产胎儿的内脏中分离到2株衣原体。将分离株鸡胚卵黄囊膜悬液接种7日龄鸡胚能导致鸡胚规律性死亡;该分离株对磺胺嘧啶(SD)具有抵抗力;碘染色阴性;补体结合试验阳性;对鸡胚致死毒价为1011EID50/0.4mL。用分离株接种豚鼠和小白鼠后,孕豚鼠在15d后出现流产,小白鼠在3d内全部死亡。从分离株中提取的DNA作为模板,应用CP特异性引物进行了聚合酶链式反应扩增,两株毒株均出现约250bp的目标扩增条带。结果表明,分离株为鹦鹉热衣原体,并将命名为CP/HH03和CP/HH28。

关键词：繁殖障碍鹦鹉热衣原体分离鉴定猪

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某猪场爆发高致病性PRRS的诊断与病毒分离鉴定

某猪场爆发高致病性PRRS的诊断与病毒分离鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：谢金文李峰沈志强任艳玲魏凤唐娜曲光刚山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点实验室山东绿都生物科技有限公司

2007年6月份,某猪场暴发一起以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,临床症状主要表现为高烧、皮肤发红、怀孕母猪流产,剖检主要特征是间质性肺炎。经过病原分离,获得一株能够引起Marc-145细胞发生病变的病毒。进一步通过血清... 详细信息

2007年6月份,某猪场暴发一起以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,临床症状主要表现为高烧、皮肤发红、怀孕母猪流产,剖检主要特征是间质性肺炎。经过病原分离,获得一株能够引起Marc-145细胞发生病变的病毒。进一步通过血清中和试验、血凝试验、RT-PCR,确定此次分离的病毒为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。综合该病的流行病学特征、临床症状、剖检病理变化以及实验室检验,确诊该病为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征。

关键词：传染性疾病细胞病变分离高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒

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用免疫抑制法制备猪瘟病毒野毒株E2蛋白的特异性单克隆抗体

用免疫抑制法制备猪瘟病毒野毒株E2蛋白的特异性单克隆抗体

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：夏照和彭伍平成丹侯强王万利孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

采用环磷酰胺免疫抑制法,用纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白作为耐受原,Shimen-E2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选获得一株稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经检测,该单克... 详细信息

采用环磷酰胺免疫抑制法,用纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白作为耐受原,Shimen-E2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选获得一株稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经检测,该单克隆抗体能够与石门株发生反应,同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群猪瘟野毒发生特异性反应,并具有中和活性,而与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应。该单克隆抗体可以用于鉴别猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白重组杆状病毒环磷酰胺免疫抑制单克隆抗体

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猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：吴波平冯力时洪艳陈建飞孙东波高秀春白兴华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室东北农业大学生命科学学院

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3mmol/LIPTG诱导后,进行We... 详细信息

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3mmol/LIPTG诱导后,进行Western blot检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。

关键词：猪捷申病毒 3D基因 RNA依赖的RNA聚合酶原核表达

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猪细小病毒LXB-PPV-20-06株NS1基因的原核表达及免疫活性的鉴定

猪细小病毒LXB-PPV-20-06株NS1基因的原核表达及免疫活性的鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：戚亭崔尚金张超范中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

利用PCR技术扩增PPVLXB-PPV-20-06株NS1基因全序列,将目的基因与原核表达载体pET-32a(+)进行连接并转化,重组质粒经PCR和双酶切鉴定并测序。测序结果表明,目的基因正确地插入到重组质粒当中。通过对表达宿主菌的选择,PPV LXB-PPV-20-06... 详细信息

利用PCR技术扩增PPVLXB-PPV-20-06株NS1基因全序列,将目的基因与原核表达载体pET-32a(+)进行连接并转化,重组质粒经PCR和双酶切鉴定并测序。测序结果表明,目的基因正确地插入到重组质粒当中。通过对表达宿主菌的选择,PPV LXB-PPV-20-06株NS1基因在Rosetta(DE)plysS菌中的到良好的表达,并确定了NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mmol/L、诱导时间为3.5h、诱导温度为37℃。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为97ku的重组蛋白,除了包涵体形式表达外,一部分重组蛋白以可溶性形式表达。重组蛋白经Western blot检测,可与PPV阳性血清反应。这为NS1蛋白在临床诊断中的应用打下基础。

关键词：猪细小病毒LXB-PPV-20-06株 NS1基因原核表达鉴定

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猪流感病毒HA基因原核表达及其初步应用

猪流感病毒HA基因原核表达及其初步应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：陈艳乔传玲丁选亚杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重... 详细信息

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1mM的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Westernblot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,经间接ELISA预试验表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因原核表达

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猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：孙东波冯力时洪艳陈建飞崔晓辰佟有恩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(S1D)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗S1D区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C... 详细信息

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(S1D)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗S1D区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1:51200、1:6400、1:12800、1:6400、1:51200和1:25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白中和表位区单克隆抗体

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猪轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

猪轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：时洪艳冯力陈建飞孙东波崔晓臣王承宝中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

本研究以纯化的原核表达的猪轮状病毒VP7抗原表位区域为抗原,建立了检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他7种常见猪病病毒(TGEV、PEDV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV、PrV)的阳性血清不发生交叉反应,批内和... 详细信息

本研究以纯化的原核表达的猪轮状病毒VP7抗原表位区域为抗原,建立了检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他7种常见猪病病毒(TGEV、PEDV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV、PrV)的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同猪场的血清的检测结果表明,该ELISA方法与中和试验检测结果符合率达94.8%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：猪轮状病毒重组VP7蛋白间接ELISA 诊断

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