马铃薯StSN2与St BIN2互作调控块茎休眠的功能解析
作者单位：西南作物基因资源挖掘与利用国家重点实验室/四川农业大学农学院
会议名称：《第二十四届中国马铃薯大会》
会议日期：2023年
关 键 词：马铃薯 休眠 StSN2 StBIN2 分子机制
摘 要：马铃薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄属植物,作为中国第四大粮食作物,其适应性强、产量高,适合大面积推广种植。中国马铃薯种植面积及产量均居世界首位,高寒山区(如乌蒙山区、秦巴山区和四省藏区等)及少数民族集中区更是马铃薯的核心主产区。加强马铃薯基础研究,对中国主粮化战略实施,保障粮食安全,实现巩固拓展脱贫攻坚成果与乡村振兴有效衔接具有重大战略意义。马铃薯块茎休眠表现为在最适宜的发芽条件下,块茎也不发芽生长的生理状态,这是马铃薯适应逆境进化中形成的特有生理过程,受内部遗传及外部环境影响。不同品种在不同的环境条件下,具有长短不同的休眠期,休眠时间大都在20～200 d,因其休眠机理未明,休眠期较难调控。不适当的休眠期导致不合时宜的萌芽,对收获后的贮藏、种薯活力、鲜食薯营养及加工薯品质等都有严重影响。在贮藏中,休眠期太短导致过早萌芽、薯块腐烂变质,直接经济损失20%～30%;在生产上,种薯休眠期与播期不匹配,造成播种期种薯活力差,苗期生长受限,减产10%以上。尤其在中国西南混作区,在马铃薯周年生产、多季节播种、多种复合种植模式下,调控种薯休眠期与贮藏期、萌芽期与播种期匹配难度更大。休眠解除后的萌芽马铃薯,因龙葵素含量高、呼吸代谢强,导致鲜食薯、加工薯品质不佳、效益下降。由于对马铃薯块茎休眠机制的认知局限,目前主要利用物理、化学方法进行种薯休眠的贮藏调控,存在效率低、毒性残留等问题。休眠难控成为制约马铃薯产业发展的瓶颈,急需通过对块茎休眠机制的基础研究,寻找调控休眠的新方法以破解产业发展难题。前期通过对休眠与萌芽的马铃薯芽眼进行转录组和蛋白质组学分析,筛选到了维持休眠的关键基因StSN2。为了研究StSN2在休眠中的功能,通过农杆菌介导的方法获得了StSN2的过表达和沉默材料。对获得的功能材料进行性状观察,发现休眠期OE-StSN2RNAi-StSN2WT,表明StSN2具有维持块茎休眠的功能。为了深入探究StSN2维持块茎休眠的分子机制,制备了StSN2的抗体,通过IP-MS的方法筛选到StSN2潜在的互作蛋白,对候选蛋白进行代谢通路分析,结果表明St SN2显著影响了激素信号转导路径,其中BR路径中的BIN2蛋白差异显著,推测StBIN2蛋白可能是StSN2潜在的互作蛋白。对StSN2功能材料进行StBIN2荧光定量和酶活检测,结果表明,在OE-St SN2中StBIN2基因的表达量WTRNAi-StSN2,其中OE-StSN2材料中StBIN2的表达量是RNAi-StSN2的5倍,WT的3倍;另外,StSN2功能材料中St BIN2酶活性差异显著,OE-StSN2材料中St BIN2酶活性WTRNAi-StSN2。采用酵母双杂、荧光素酶互补试验以及免疫共沉淀实验,均证实了St SN2与StBIN2之间存在蛋白互作。St SN2与StBIN2通过蛋白互作的方式维持块茎休眠,解析二者的互作机制有助于解析StSN2的调控休眠的分子机制。蛋白预测StBIN2具有激酶结构域,为了验证St SN2与StBIN2的激酶结构域互作,根据StBIN2蛋白结构的特点,将St BIN2蛋白分成三段,分别命名为StBIN2-N1、 StBIN2-N2、 StBIN2-N3,然后分别构建到pGADT7载体上,与BD-StSN2共转化到AH109酵母中,涂布到二缺和四缺培养基上, 28℃培养3 d,结果表明,只有AD-StBIN2-N2与BD-StSN2在含有X-α-gal的四缺培养基上生长且显变蓝,也就是含有激酶结构域的区域,从而表明StBIN2的激酶结构域负责与StSN2互作。为检测互作后StBIN2酶活性变化,原核表达纯化了StSN2与StBIN2蛋白,将StSN2与StBIN2蛋白按照1∶1、 2∶1、 3∶1、 4∶1的比例进行孵育,然后按照激酶反应试剂盒操作检测StBIN2的激酶活性,结果发现随着StSN2蛋白的增多, St BIN2消耗ATP的量逐渐增多,酶活性差异显著。另外,在荧光素酶互补实验中,将St SN2-c LUC菌液与StBIN2-nLUC按比例混匀注射本氏烟草叶片,发现随着StSN2菌液添加比例的增多,互作的荧光不断增强,检测烟草叶片中St BIN2的酶活性,结果表明StBIN2的酶活性随着StSN2菌液的增加而增强且差异显著。体内和体外实验均证明, St BIN2与StSN2互作后其酶活性增强,推测互作后的StBIN2通过介导ABA与BR信号转导来维持块茎休眠。为探求StBIN2是否也具有维持块茎休眠的功能,通过农杆菌介导的方法获得了StBIN2的过表达材料,性状检测结果表明OE-StBIN2能够延长块茎休眠,其表型与OE-StSN2一致。将收获的St SN2与StBIN2材料块茎进行贮藏, 30