紫苏种子TAG合成酶基因的克隆与功能分析
作者单位：山西农业大学分子农业与生物能源研究所
会议名称：《第十九届中国作物学会学术年会》
会议日期：2020年
关 键 词：紫苏(Perilla frutescens (L.) Britt.) TAG合成 二酰甘油酰基转移酶(DGAT) 磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT) 基因沉默 酵母功能互补测试 转基因烟草
摘 要：【研究背景】紫苏(Perillafrutescens)是一种新型食药同源的油料作物,种子含油量高(46%～58%),其中α-亚麻酸(ALA,18:3Δ9,12,15)含量高达55%～67%,是一种人体营养和健康必需ω-3脂肪酸的理想资源。尽管紫苏油在食品、医药和化妆品等产业应用需求及种植规模日益增加,种子油脂合成,特别是ALA富集机制还不清楚。基于前期转录组和基因组测序数据,本文聚焦控制三酰甘油(triacylglycerol, TAG)生物合成最后一步酰化反应的两类酶(依赖和不依赖于脂酰-CoA的酰基转移酶)基因分子克隆和功能鉴定,从植物油脂合成途径库端解析紫苏种子油脂和ALA富集及调控分子机制;【材料与方法】本研究以富ALA的高油紫苏品种‘晋紫苏1号’为材料,对发育种子进行转录组测序和转录本功能注释;分别克隆PfDGAT1(diacylglycerol acyltransferase1)、 PfDGAT2(diacylglycerolacyltransferase2)和PfPDAT1(phospholipid:diacylglycerolacyltransferase1);定量分析这三个基因在紫苏不同组织器官和种子发育不同时期的表达谱;分别构建这三个基因的酵母和植物过表达载体,分别转化TAG缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变株H1246和普通烟草(Nicotiana tabacum),并对转化体进行表型鉴定,分析编码酶蛋白的生物学功能;【结果与分析】发育种子转录组分析获得一组参与种子脂肪酸从头合成和油脂代谢的重要基因,包括酶基因和转录因子。分离获得编码PfDGAT1、PfDGAT2和PfPDAT1酶蛋白的c DNA克隆。qRT-PCR分析显示这3个基因表达具有组织特异性,尤其是PfPDAT1在发育种子中后期和发育的花组织中高量表达。酵母功能互补试验和TLC分析证实这三个酶蛋白均能使酵母H1246突变体恢复TAG合成,表明这三个酶蛋白具有酰基转移酶活性。活体和离体酶活性测试显示,PfDGAT1和PfDGAT2能有效催化酰基-CoA和DAG(diacylglycerol)生成TAG,PfPDAT1可催化脂肪酸酰基从PC(phosphatidylcholine)分子转移整合到DAG的sn-3碳原子生成TAG。底物特异性分析显示,PfDGAT2对油酸酰基选择性较高,然而PfPDAT1对ALA酰基具有极强的底物选择性。转基因烟草总脂肪酸含量及脂肪酸各组分含量分析表明,分别过表达PfDGAT1、PfDGAT2和PfPDAT1基因,均导致烟草叶片和种子总油脂积累量显著增加和不饱和脂肪酸含量升高。尤其是转PfPDAT1基因植株ALA含量比野生型和其他两个转基因烟草高出2倍多。更为重要的是,PfPDAT1过表达促使烟草种子体积增大,表明PfPDAT1基因不仅控制ALA和油脂富集,还在在种子发育和种子形成中行使重要功能。分别沉默这三个基因导致紫苏愈伤组织油脂含量不同程度减少;【结论】紫苏PfDGAT1、PfDGAT2和PfPDAT1基因编码的酶蛋白均能高效催化TAG合成,是紫苏种子油脂积累和不饱和脂肪酸富集的重要贡献者。特别是异源过表达PfPDAT1可促进油脂及ALA富集和种子增大,可进一步应用于油料作物遗传改良提高种子油脂和α-亚麻酸产量。