柔嫩艾美耳球虫GDH定点突变体构建及其重组表达
作者单位：广东省农业科学院动物卫生研究所农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东省畜禽疫病防治研究重点实验室
会议名称：《中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛》
会议日期：2019年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
基 金：国家重点研发计划资助项目(2016YFD0501303,2017YFD0501205,2017YFD0500400) 国家自然科学基金项目(31872460,31602044,31402186) 广东省乡村振兴战略专项(201817SY0003) 广东省自然科学基金(2018A030313925) 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金(2019KJ119) 广东省重点领域研究计划项目(2019B020218004) 广东省农业科学院寄生生物学团队建设项目(201623TD)
摘 要：鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种寄生于鸡盲肠的单细胞寄生性原虫,可导致鸡盲肠肠道出血,严重者引起死亡,对养禽业造成严重的经济损失。谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)在细胞内信号转导、三羧酸循环、氨代谢和能量代谢等多种细胞生理过程中起重要的作用,最近有研究报道该蛋白可作为抗恶性疟原虫药物设计的潜在药靶。本研究在实验室前期克隆的鸡柔嫩艾美耳球虫谷氨酸脱氢酶基因(Etgdh)的基础上,将EtGDH酶活性位点突变,以确定探讨EtGDH的关键催化位点,为抗鸡球虫药物筛选提供研究基础。通过结构预测与同源性分析,筛选EtGDH的酶活性位点,构建了EtGDH-K133A等12个突变体。分别与载体pET-32a连接后构建pET-32a-EtGDH突变体重组质粒,重组质粒经PCR鉴定及测序,与预期结果一致。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌*** Rosetta (DE3)菌株,将鉴定为阳性的*** Rosetta (DE3)(pET-32a-EtGDH突变体重组质粒)以0.1mM IPTG,16℃低温诱导表达,再以Ni-NTAHis Bind Resins纯化12个rEtGDH突变体蛋白。结果获得条带大小约为73 kDa的纯化目的蛋白。柔嫩艾美耳球虫GDH突变体的构建及重组表达,为后续明确EtGDH在酶催化功能上的意义及抗鸡球虫药物筛选方面奠定了一定基础。