大片形吸虫TGR的酶活性研究及其呋咱类抑制物的筛选
作者单位：中国农业科学院上海兽医研究所 山东大学
会议名称：《中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛》
会议日期：2019年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：片形吸虫病是由大片形吸虫和肝片形吸虫寄生在草食性哺乳动物的肝胆或人体内引起的一种人畜共患寄生虫病。硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(TGR)是吸虫氧化还原系统中一个非常重要的抗氧化酶。本研究通过呋咱类衍生物与大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(FgTGR)相互作用,检测其对FgTGR酶活性的抑制效果,为研发新的抗片形吸虫药物提供依据。利用PCR技术从大片形吸虫cDNA中扩增得到FgTGR基因,并将细菌的SECIS序列融合到FgTGR的开放阅读框末端,形成嵌合基因FgTGRsec,构建FgTGR的重组原核表达质粒pET28a (+)-FgTGRsec,并与pSUABC质粒共转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过His-tag蛋白纯化琼脂糖磁珠进行重组蛋白的纯化。建立以5,5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)为底物,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为辅酶的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性检测体系,计算重组大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶硒蛋白(rFgTGRsec)的TrxR活性。检测合成的55个呋咱类化合物对rFgTGRsec的TrxR活性的抑制效果。PCR扩增得到分子量为2028 bp的特异性DNA条带,与预期的FgTGR大小相符。成功构建了pET28a (+)-FgTGRsec重组表达质粒并在大肠杆菌中表达,诱导表达的rFgTGRsec以可溶性蛋白和包涵体的形式存在,大小约75 kDa。纯化所得的可溶性rFgTGRsec的米氏常数Km (DTNB)为0.25±0.06。在检测的55个呋咱类化合物中,ZWJ-19和CH-33具有较好的酶活抑制效果,其中ZWJ-19在终浓度为200μM时达到88.96%的最大抑制率,IC50为3.82±0.33μM;而CH-33在终浓度为100μM时达到81.18%的最大抑制率,IC为18.54±2.57μM,而其余53种呋咱类化合物的最大抑制率均未达到80%。本研究成功得到了大片形吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶硒蛋白,在检测的55种呋咱类衍生物中,ZWJ-19和CH-33对rFgTGRsec的TrxR酶活性有较好的抑制效果,本研究对后续FgTGR的抑制物筛选以及研制新的抗片形吸虫药物奠定了基础。