溶酶体损伤参与碳点诱导的细胞自噬及调控机制
会议名称：《中国毒理学会第九次全国毒理学大会》
会议日期：2019年
学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学]
摘 要：目的碳点（Carbon dots,CDs）作为一种新型的荧光量子点,因具有良好的荧光特性和低毒性、成本低等优点,在细胞成像和靶向诊断等方面具有潜在应用前景,然而其毒性研究资料尚且缺乏。已知肝脏是CDs进入体内后的主要蓄积器官,进入细胞中的CDs可以靶向溶酶体,然而聚集在溶酶体中的CDs是否会参与细胞自噬或者引起细胞毒性并不清楚,本研究探讨CDs引起肝细胞溶酶体损伤与溶酶体损伤在CDs引起肝细胞毒性的作用和机制。材料和方法以不同类型肝细胞（小鼠正常肝细胞AML12,小鼠肝癌细胞Hep1-6和小鼠肝巨噬细胞KUP5）为细胞模型,采用MTT法观察CDs引起细胞生存率的改变,激光共聚焦观察CDs在细胞内的分布,使用Lyso-Tracker Red探针观察CDs引起溶酶体数量改变,Lysotrackergreen DND观察溶酶体PH值的变化,电镜观察细胞内自噬小体的形成,激光共聚焦显微镜观察CDs引起不同类型细胞自噬流的变化以及TFEB核转位情况,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、beclin-1,细胞浆和细胞核内TFEB的表达以及mTOR和ERK信号通路关键蛋白的改变。结果 CDs处理KUP5细胞、AML12细胞和Hepa1-6细胞24 h后,KUP5细胞和AML12细胞存活率显著降低,Hepa1-6细胞存活率略有降低;三种肝细胞在CDs处理细胞后可观察到自噬小体的存在,在Hepa1-6细胞出现了细胞自噬的水平LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平升高,p62未发生明显的变化,AML12细胞和KUP5细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62表达均升高,以KUP5最为明显,发生明显的自噬流受阻;进一步研究发现CDs被三种肝细胞摄取的CDs聚集在溶酶体,且引起溶酶体数目减少和PH升高;CDs诱导的溶酶体改变与其引起三种肝细胞内转录因子TFEB核转位的发生相关,CDs暴露三种肝细胞3 h,高剂量组细胞核内TFEB蛋白表达量显著升高,细胞浆内TFEB蛋白表达量明显降低;KUP5细胞内mTOR通路在6 h时被激活,而TEFB在3h时已经入核,因此,KUP5细胞内CDs诱导的TFEB核转位为mTOR非依赖的,而ERK通路未被激活;AML12细胞和Hepa1-6细胞内mTOR和ERK通路在3 h时均被激活,CDs诱导的AML12细胞和Hepa1-6细胞内TFEB核转位为mTOR和ERK通路协同参与。结论 CDs可引起三种不同类型肝细胞损伤作用,以肝巨噬细胞KUP5最为明显、AML12次之,对肝癌细胞Hepa1-6损伤最小,其引起的肝细胞损伤作用与溶酶体参与诱发自噬性细胞死亡相关,mTOR和ERK通路协同或分别参与诱导TFEB核转位介导CDs诱导的溶酶体损伤和自噬性细胞死亡过程。