MicroRNA143c介导中国甜柿自然脱涩的功能研究
作者单位：华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 黄冈师范学院大别山特色资源开发湖北省协同创新中心/经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室
会议名称：《中国园艺学会2019年学术年会暨成立90周年纪念大会》
会议日期：2019年
学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学]
关 键 词：中国甜柿 自然脱涩 microRNA ALDH 凝固效应
摘 要：与日本甜柿自然脱涩时期早(花后10周)且受稀释效应(果肉细胞中单宁细胞数量和所占比例下降)影响明显有别,中国甜柿在成熟前(花后25～27.5周)才能自然脱涩,且主要涉及可溶性单宁的不溶化(简称自然凝固效应)。已知中国甜柿自然脱涩性状受一个显性基因位点控制,但与自然脱涩相关的主效基因及其遗传调控网络尚不完全清楚。探讨microRNA及乙醛脱氢酶基因(ALDH)在中国甜柿自然脱涩的功能特点,以期为解析中国甜柿自然脱涩的分子调控网络提供科学依据。材料为‘鄂柿1号’(中国甜柿)、‘阳丰’(日本甜柿)和‘磨盘柿’(非完全甜柿)花后2.5、5、10、15、20、25和27.5周的果实以及‘恭城水柿’(非完全甜柿)花后10周的果肉组织,以及本氏烟草(NicotianabenthamianaDomin.)。进行了原花青素含量测定,RNA提取和cDNA合成,qRT-PCR,miRNA143c及Dk ALDH10克隆、序列分析及载体构建,miRNA靶切位点验证,活体叶片和果实圆片瞬时表达,叶片稳定遗传转化,DMACA染色,酵母双杂交,生物信息学分析等工作。前期已经报道DkALDH基因家族与中国甜柿可溶性单宁自然凝固直接相关。本试验中利用‘鄂柿1号’花后15周、20周果实miRNA数据库以及柿转录组数据库筛选获得miRNA143c,其预测靶基因为DkALDH10,5′RACEPCR克隆测序结果表明miRNA143c特异的剪切位点位于相应的miRNA序列的第9～10个碱基间。GUS染色以及LUC酶活检测表明miRNA143c与DkALDH10存在互作;通过活体柿叶和离体果实圆片瞬时超表达miRNA143c后,DkALDH10表达量显著降低,干涉表达miRNA143c(STTM143c)后,DkALDH10表达量显著升高。利用农杆菌介导的柿组培苗叶片稳定遗传转化技术分别获得超表达miRNA143c株系2#、4#、7#及STTM143c干涉株系3#、4#、5#,对转基因植株愈伤染色后发现,干涉株系愈伤颜色较深,超表达miRNA143c株系愈伤颜色明显浅于对照,表明其可溶性单宁含量较干涉系植株明显降低;在超表达miRNA143c植株中DKALDH10表达量显著降低,可溶性单宁含量降低而不溶单宁含量升高;在STTM143c植株中DKALDH10表达量显著升高,可溶性单宁含量显著升高而不溶单宁含量降低。此外,还对DkALDH10进行酵母文库筛选,经过序列Blast分析鉴定到一个与之互作的ERF1转录因子。综上所述,miRNA143c通过抑制DkALDH10表达而参与乙醛代谢和中国甜柿自然脱涩过程的调控。