爪哇根结线虫RPA-LFD检测方法的建立
作者单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所 安徽农业大学植物保护学院
会议名称：《中国植物病理学会第十一届全国会员代表大会暨2018年学术年会》
会议日期：2018年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学]
摘 要：RPA(recombinase polymerase amplifcation)是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的核酸检测技术,该技术可以在37～42℃的恒温条件下,利用1对引物在短时间内实现核酸靶标片段的快速扩增,结合侧向试纸条(1ateral flow strips,LFD)检测,实现核酸的快速扩增和结果的可视化检测。本研究根据爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)的ITS等序列信息,通过生物信息学分析,分别设计了5对RPA引物,根据扩增特异性,从中筛选出1对可以特异检测***的引物:MjR2F(5’-ATACCGTAAAAGCTCTAATTAAAGCCCGGTTC-3)和MjR2R(5’-CCATTTCCGATTTCCGACAGTTCCCATTTCCG-3’),以***的DNA为模板,利用该引物进行RPA反应,可以获得长度为312 bp的单一条带;根据扩增序列设计标记探针MjPro:FITCCCTTCACTAATAGAAGCCCATCTCTAAT ATAA-dSpacer-CCCACTCAAGGAGGCC-ddC,添加探针进行RPA反应后,使用侧向流试纸条对反应产物进行检测,仅有以***基因组DNA为模板的试纸条质控条带和阳性指示条带均显色,以其他7种植物寄生线虫DNA为模板的反应产物检测结果均为阴性;另外,结果表明,本研究中RPA-LFD能够检测DNA的最低浓度为10 pg/μL。本研究提供了爪哇根结线虫RPA-LFD快速、可视化检测方法,其在生产上有较好的应用前景,同时对其他病原物LFD-RPA检测方法的探索有一定的借鉴意义。