人脐血内皮祖细胞的分离及动物学实验研究
作者单位：温州医学院附属二院手外科
会议名称：《2013中国工程院科技论坛暨浙江省骨科学学术年会》
会议日期：2013年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学]
摘 要：方法 1、EPCs的分离、培养和鉴定采集50mL胎盘端脐带血行脐带静脉血单个核细胞的分离培养,分离单个核细胞。高倍倒置显微镜对内皮祖细胞进行形态学观察。将细胞接种到培养皿后,第2天观察部分细胞开始贴壁,第3天贴壁细胞开始变为短梭形,由于在第7天时贴壁细胞已牢固贴壁,大部分非贴壁细胞通过换液去除,因此培养7d时,高倍倒置显微镜下随机选取6个视野,计数铺有纤维连接蛋白孔与未铺纤维连接蛋白孔中贴壁细胞的数量。从接种到一次性培养瓶中开始观察细胞形态,直到贴壁细胞已达培养瓶面积80%以上时传代细胞,观察贴壁细胞到40d。培养第7天,用免疫荧光法对内皮祖细胞进行鉴定,参照文献,观察其吞噬DiI-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力,DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞视为正在分化的EPC。第14天可见细胞呈铺路石样排列,并观察CD31、CD144、vWF、VEGFR-2抗原的表达情况。2、按照TongucIsken等人研究的大鼠糖尿病造模方法,选择持续6周时间的糖尿病大鼠且血糖大于200 mg/dL为标准。采用改良的McFarlane皮瓣制作方法,1 0%水合氯醛腹腔注射麻醉,将动物俯卧位固定,脱毛,碘伏消毒,铺巾。以大鼠尾部两髂嵴连线为蒂,在背部正中设计一宽3 cm、长9 cm矩形随意型皮瓣。实验组采用皮瓣下直接注射带有EPCs的细胞悬液1ml,对照组注射生理盐水1ml,观察两组皮瓣的成活面积。结果 1、通过激光共聚焦显微镜和免疫组织化学染色均观察到EPCs。2、动物实验显示注射EPCs组的皮瓣成活面积较未未注射EPCs组大。结论 1.本研究在脐血的单个核细胞贴壁生长后的第7天进行鉴定,包括:摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力;激光共聚焦显微镜观察可同时显示红色和绿色荧光。第14天免疫组化显示CD31、CD144、vWF、VEGFR-2表达均呈阳性提示分离培养的细胞具有内皮祖细胞的特征,且有较强的增殖活性。2.本实验于皮瓣局部注射EPCs细胞悬液,可能增加了局部的EPC的数量,从而使局部血管生成加速,改善局部缺氧,进而促进皮瓣成活。3.该过程亦可能存在更加复杂的细胞因子调控方面的影响,具体的机制有待进一步更加深入的研究。