一例猪瘟病毒的分离与鉴定
作者单位：河南科技学院动物科学学院 新乡学院生命科学与技术系生物技术研究中心
会议名称：《中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中...》
会议日期：2015年
学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV株）免疫猪群在血清学上无法与自然感染猪群进行区分。文献报道CSFV的E0、E2和NS5B基因分群结果是一致的,初步认为3个基因在系统发生分析中具有高度的一致性。而Wu H X等对C-株全基因组测序后发现CSFV C-株在基因组的3’-UTR区域较石门株多了1个富含T的短片段差异序列,提出这个分子标记是CSFV强毒适应兔体致弱而产生的遗传标记,利用这一特点可以区分猪瘟强毒与疫苗毒。2013年11月新乡地区一猪场发生疑似猪瘟病,采集疑似猪瘟病猪淋巴组织,用PK-15细胞分离培养病毒,将分离的病毒液接种至长成70%的单层PK-15细胞,培养48h后取出,免疫组织化学染色,观察。根据Gen Bank收录的CSFV C株基因序列设计了扩增基因的特异性引物,C-株疫苗株和石门株扩增片段大小分别为279bp和266bp。引物序列为:上游引物TGGTGTTAAGGAGGCTGAGAG;下游引物CCTTAGTCCAACTGTGGACGT。提取病毒总RNA,并扩增CSFV NS5B,将PCR产物进行凝胶电泳进行鉴定。将PCR产物进行序列测定,并用DNAstar软件将分离株核苷酸序列与经典强毒株shimen、Alfort、Brescia和弱毒疫苗株HCLV、KC和India 6株参考株全基因序列进行比较分析。构建CSFV毒株间遗传关系的系统进化树并分析。结果表明接种分离病毒样品的细胞有明显的棕黄色着染现象,而正常对照细胞无染色现象;从病毒液中提取的RNA经反转录及PCR扩增后出现了预期大小的目的片段,证实采集的病料中含有猪瘟病毒。测序结果,NS5B片段的测出序列与shimen株的同源性为99.6%,与Alfort株的同源性为97.3%,与Brescia株的同源性为97.3%,与HCLV株的同源性为97.8%,与KC株的同源性为95.1%,与India株的同源性为96.9%。说明该猪瘟病毒与shimen株同源性最高,且无明显差异。最终证实该分离毒株是shimen株。本研究方法具有检出率高、精确等优点,对于CSFV新毒株的发现以及猪瘟的分子流行病学的研究具有重要意义。