骨髓间充质干细胞维持原代猪肝细胞形态与功能的实验研究
作者单位：南京医科大学鼓楼临床医学院肝胆外科 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科
会议名称：《第一届全国疑难重型肝病大会、第四届全国人工肝及血液净化学术年会》
会议日期：2008年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学]
关 键 词：共培养 异质细胞间相互作用 猪肝细胞 骨髓间充质干细胞 生物人工肝
摘 要：目的:探索猪肝细胞与骨髓间充质干细胞体外最适共培养体系,为生物人工肝的构建提供理想细胞来源。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,流式细胞仪分别鉴定 CD29、CD44、CD45 和 CD90比例。原位两步胶原酶法分离猪肝细胞,台盼兰拒染实验判断肝细胞活率,抗白蛋白、CK18免疫细胞化学染色鉴定肝细胞纯度。将肝细胞与骨髓间充质干细胞(MSCs)按照不同比例随机混合培养,观察各组肝细胞形态和功能变化。结果:第3代 MSCs 纯度95%, 新鲜分离的肝细胞活率95%,纯度99%。共培养组肝细胞迅速粘附于 MSCs 表面,并呈球形聚集生长;电镜发现共培养组异质细胞问出现细胞连接,超微结构与正常肝细胞接近;共聚焦显微镜示异质细胞间呈三维分层生长;细胞活力染色观察见共培养组死细胞明显较对照组减少。肝细胞/MSCs 2:1组白蛋白分泌水平和尿素合成能力自第1天培养起均显著高于其余各组(P0.05),并在第2天达到高峰,随后缓慢下降;实验组肝细胞内白蛋白免疫细胞化学染色较对照组增高;肝细胞糖原染色亦明显强于对照组。经流式细胞仪分选2:1共培养组肝细胞,Western Blotting 检测提示肝细胞内白蛋白和 CYP3Al 合成均较其余共培养组显著增高(P0.05)。细胞周期检测示共培养组肝细胞 G2-S 期细胞明显增加(P0.05)。结论:MSCs 与原代猪肝细胞共培养可维持肝细胞形态与功能。2:1共培养组培养至第2天为最适共培养体系,可应用于生物人工肝的构建。