柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP39基因特性的初步研究
作者单位：中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室 上海师范大学生命与环境科学学院 云南农业大学动物科学技术学院
会议名称：《中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会》
会议日期：2015年
学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
关 键 词：球虫 顶体膜抗原1 保守蛋白 EtCHIP39 入侵
摘 要：本实验室前期利用酵母双杂交技术,以柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原1(EtAMA1)为诱饵,筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,获得一些潜在的与EtAMA1相互作用蛋白的ESTs序列。本研究选择其中一条编号为CHIP39的EST序列进行研究。该序列含有3,末端的Ploy(A)尾,利用5’RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,并对该基因的生物信息学信息、转录水平分析、免疫定位分析和体外抑制等进行了研究。研究结果表明,该基因全长1344bp,ORF长873bp,编码290个氨基酸,预测分子量为32.6kDa,无跨膜结构和信号肽,没有保守结构域,具有多个抗原位点,与柔嫩艾美耳球虫保守的假象蛋白(hypothetical protein,conserved,ETH 00029745)100%同源,因此,将该基因命名为EtCHP39。EtCHP39基因在球虫4个发育阶段均有转录,但转录水平不同,其中在孢子化卵囊阶段转录水平最高,其次在未孢子化卵囊的转录水平高于子孢子和裂殖子的,表明其转录水平受到虫体阶段性的调控。对EtCHP39蛋白进行原核表达,纯化,制备多抗。Western-blot分析表明重组蛋白EtCHP39具有良好的抗原性。采用间接免疫荧光技术对EtCHP39蛋白在球虫不同发育阶段的分布进行了分析,发现其在入侵前主要位于子孢子的顶端,当准备入侵时分泌到子孢子的表面以及顶端;子孢子入侵细胞2h后,该蛋白主要位于虫体的顶端,24h后,蛋白的表达增加,且逐渐往虫体的后端分泌,当虫体发育为裂殖子时,该蛋白主要位于裂殖子的顶端。通过体外抑制实验检测不同浓度的EtCHP39多抗对子孢子入侵DF-1细胞的影响,发现anti-rEtCHP39抗体作用子孢子后,与对照组相比,子孢子入侵DF-1细胞的能力下降,且随着抗体浓度的不断增大,作用后子孢子入侵力逐渐降低,抗体抑制率逐渐升高,当抗体浓度为400μg/mL,抑制率为30%左右。以上结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫CHP39蛋白的功能提供了重要参考依据。