CYP2A13在低浓度黄曲霉毒素B1所致BEAS-2B细胞恶性转化中的作用
作者单位：南京医科大学公共卫生学院现代毒理学教育部重点实验室
会议名称：《中国毒理学会第六届全国毒理学大会》
会议日期：2013年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学]
摘 要：目的本研究利用稳定表达CYP2A13的人支气管上皮细胞(BEAS-2B),系统探讨CYP2A13在低浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)所致人支气管上皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,为阐明AFB1与人群呼吸系统肿瘤的关系、并为AFB1的健康风险评估提供重要线索和技术支撑。方法利用慢病毒系统分别构建稳定表达CYP2A13的BEAS-2B(B-2A13)单克隆细胞、B-1A2细胞(AFB1的优势代谢酶)、B-2A6细胞(CYP2A13的同源酶)以及B-Vector细胞(空载细胞)。AFB10.1～10 nmol·L连续处理上述细胞30～50代,通过软琼脂集落实验、划痕实验以及裸鼠荷瘤实验比较AFB1对不同细胞的恶性转化效应。在此基础上,运用免疫荧光检测细胞的AFB1-DNA加合物和8-OHdG的含量、流式细胞仪检测细胞的凋亡、Western blot检测相关蛋白的表达,初步分析其作用机制。最后,再利用siRNA干扰和关建蛋白的抑制剂等进一步确认相关的分子机制。结果与B-Vector相比,不同浓度AFB1处理40代(P400的B-2A13,B-1A2细胞,其克隆形成数目以及迁移能力显著增加,而B-2A6与B-Vector相似,未见明显的克隆形成和迁移能力的改变。裸鼠荷瘤实验证实,PB-2A13即可使裸鼠皮下成瘤,而P B-1A2才能使裸鼠皮下成瘤,PB-2A6则和B-Vector细胞一样,不能使裸鼠皮下成瘤。显示低浓度AFB1可经CYP2A13或CYP1A2的代谢活化而诱发细胞发生恶性转发并致瘤,但CYP2A13的能力明显高于CYP1A2。与B-Vector相比,AFB1 0.1 nmol·L处理可引起P B-2A13显著的DNA损伤,AFB1-DNA加合物、8-OHdG生成增加,DNA损伤修复相关蛋白如p-ATR,p-BRCA1,Rad51,Mre11和Rad50表达显著增加。此外,AFB10.1 nmmol·L处理的P细胞凋亡率显著增加,而PB-2A13细胞的凋亡则下降至未处理细胞的水平,提示长期持续处理,细胞出现了抗凋亡现象,可能与细胞的恶性转化有关。ATR-siRNA或NU6027(ATR的抑制剂)与AFB1联合处理,可以显著增加P B-2A13细胞凋亡,并与PB-2A13细胞的凋亡相当。ATRsiRNA或NU6027可以显著地抑制AFB1诱导的DNA损伤修复相关蛋白如p-ATR,p-BRCA1,Rad51,Mre11,Rad50的激活,还可以使PB-2A13细胞中Bax,C-胱天蛋白酶3等表达增加,但对PB-Vector细胞无显著影响。软琼脂集落实验进一步显示,ATR-siRNA或NU6027可以显著地抑制PB-2A13在软琼脂上的锚定生长。结论 CYP2A13的代谢活化在低浓度AFB1导致的BEAS-2B恶性转化中发挥了关键作用;ATR介导的DNA损伤修复与凋亡失衡是其作用的重要途径和分子机制。