Survivin启动子调控的hTERT基因shRNA表达载体的构建及对肿瘤特异性靶向作用研究
作者单位：泸州医学院医学细胞生物学与遗传学教研室
会议名称：《中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会》
会议日期：2011年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
基 金：四川省卫生厅资助(060062)
关 键 词：survivin启动子 hTERT基因 RNAi 肿瘤特异性
摘 要：人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的核心组分,与包括乳腺癌、肝癌等在内的多种肿瘤的发生、发展密切相关,研究表明抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。但除了90%的肿瘤细胞,人类的少数正常细胞如正常胚胎细胞、生殖细胞、干细胞、活化的白细胞等亦具有端粒酶活性,端粒酶的表达对这些细胞的分裂和增殖同样具有重要意义。RNAi虽然能够高效地抑制基因的表达,但缺乏特异性。为了让RNAi在有效抑制肿瘤细胞中端粒酶活性的同时,对正常细胞无影响,本研究构建了带有肿瘤特异性survivin启动子、针对hTERT基因的shRNA表达载体pYr-survivin-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及对肿瘤细胞生长增殖的影响。文章分别用针对hTERT基因的RNA干扰寡核苷酸序列及survivin启动子取代质粒pYr-Micro30中原有的miR30序列及CMV启动子,构建pYr-survivin-miR30-hTERT载体并进行酶切及测序鉴定,同法构建CMV对照组质粒pYr-CMV-miR30-hTERT及阴性对照组质粒pYr-miR30-NC。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HEPG-2细胞及293T细胞,并设立survivin实验组、CMV对照组、阴性对照组和空白组,荧光显微镜下观察各种细胞的荧光表达情况,RT-PCR及western blot法检测肿瘤细胞中各组hTERT mRNA和蛋白的表达情况,CCK-8检测各组肿瘤细胞的生长增殖情况。重组质粒经酶切及测序鉴定证实符合设计要求,构建成功;荧光结果表明,与对照组相比,survivin实验组质粒仅在两种肿瘤细胞中表达绿色荧光,转染效率为70%左右,而在293T细胞中则未见荧光细胞,RT-PCR和western blot的结果均显示两种肿瘤细胞的survivin实验组和CMV对照组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05),CCK-8检测结果也表明两种肿瘤细胞的survivin实验组和CMV对照组增殖抑制明显(P0.05)。结果证实survivin启动子调控的hTERT基因的shRNA表达载体能有效抑制survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,抑制细胞生长,而对正常细胞不产生影响。