胰岛素调控明小花蝽生殖发育的机制研究
作者单位：长江大学
学位级别：硕士
导师姓名：董小林;翟一凡
授予年度：2024年
主 题：明小花蝽 胰岛素受体 RNAi 胰岛素信号通路 生殖发育
摘 要：明小花蝽(Orius nagaii)作为一种重要的捕食性天敌昆虫,被广泛应用于防治蓟马、叶螨、蚜虫、粉虱等多种小型害虫及鳞翅目害虫的低龄幼虫。明小花蝽的室内饲养产卵能力量高,适应性强,可进行大量工厂繁育,具有较高的生防应用潜能。研究明小花蝽生殖发育特性,有利于提高饲养效率,促进工业化生产。本研究围绕胰岛素和胰岛素信号通路调控明小花蝽生殖的分子机制进行研究,为明小花蝽的生殖发育提供理论基础。 胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)因广泛参与昆虫的生长发育、繁殖、物质代谢、衰老和寿命等生理过程而备受关注。本研究以明小花蝽作为试验对象,通过注射外源牛胰岛素明确胰岛素对明小花蝽雌虫Vg蛋白、卵巢发育、产卵量、糖脂含量、保幼激素和蜕皮激素滴度变化的影响;基于明小花蝽转录组数据库信息,运用RACE技术克隆两个胰岛素受体(On In R1、On In R2)的c DNA序列,并利用生物信息学软件进行分析,采用荧光定量PCR技术分析两个胰岛素受体基因在明小花蝽不同发育时期、不同组织的表达模式;利用RNAi干扰技术探索了胰岛素受体对明小花蝽卵黄原蛋白和卵巢发育的影响,以及对其糖脂含量、保幼激素和蜕皮激素滴度的影响。主要研究结果如下: 1.探究胰岛素对明小花蝽生殖发育的影响。结果表明,与对照组(PBS)相比,胰岛素(0.05 mg/m L)可以加速卵巢发育,增加产卵量,产卵前期缩短,这表明了胰岛素信号参与明小花蝽生殖发育调控;明小花蝽注射胰岛素72 h后,卵黄原蛋白表达含量明显升高,葡萄糖、海藻糖和甘油三酯含量均明显下降,糖原含量、保幼激素滴度和蜕皮激素滴度均明显升高。胰岛素/胰岛素信号参与明小花蝽卵巢发育、糖脂的代谢以及保幼激素和蜕皮激素的调控,并进一步调节昆虫卵黄发生。 2.胰岛素受体的功能分析。通过RACE克隆得到明小花蝽两个胰岛素受体On In R1和On In R2的c DNA序列,全长分别为5301 bp和4674 bp,其开发阅读框(ORF)分别为2769 bp和2280 bp,分别编码922和759个氨基酸残基。理论等电点分别为6.42和5.41,脂肪系数分别为77.17和83.53,亲水性平均值分别为-0.510和-0.310,疏水性分析表明On In R1和On In R2是亲水性蛋白。同其他物种的序列比对后发现明小花蝽两个胰岛素受体都具蛋白激酶超家族酪氨酸激酶催化结构域Tyr Kc。系统发育分析表明,明小花蝽In Rs与半翅目褐飞虱昆虫聚为一支,表明明小花蝽的In Rs与褐飞虱的In Rs在进化上具有高度的保守性。 3.对不同组织和不同发育时期的明小花蝽进行荧光定量分析。在组织表达中,On In R1在肠道和卵巢表达较高,On In R2基因在卵巢表达较高,On In R1和On In R2在头胸部表达量最低;在发育时期中,On In R1和On In R2基因在卵期表达含量达到最高峰,若虫期和成虫期均有表达。在若虫阶段,On In R1基因在2龄表达含量较高、5龄表达含量较低。On In R2基因的表达含量在5个龄期之间没有显著性差异;在成虫阶段,On In R1基因在雌成虫和雄成虫表达含量没有显著性差异。雌成虫On In R2基因的表达含量显著高于雄成虫。胰岛素信号通路参与明小花蝽卵子和卵巢的发育以及肠道的消化吸收。 4.胰岛素受体对明小花蝽生殖发育的影响。通过注射ds RNA成功干扰明小花蝽On In R1基因,沉默效率在24 h、48 h、72 h分别达到96.16%、99.71%、70.30%。其中On In R1基因沉默72 h后,雌成虫卵巢发育不健全,Vg基因转录水平降低了67.62%,其产卵量显著降低,产卵前期延长。明小花蝽On In R1表达被抑制后,卵黄原蛋白表达含量明显降低,葡萄糖、海藻糖和甘油三酯含量均明显升高,糖原含量、保幼激素滴度和蜕皮激素滴度均明显降低;通过注射ds RNA成功干扰明小花蝽On In R2基因,沉默效率在24 h、48 h、72 h分别达到89.08%、66.03%、59.17%。On In R2基因沉默72 h后,Vg基因转录水平降低了52.87%,产卵量显著低于对照组,卵巢里有数量不多的成熟卵母细胞。明小花蝽On In R2表达被抑制后,卵黄原蛋白表达含量明显降低、葡萄糖和甘油三酯含量均明显升高,糖原含量和保幼激素滴度均明显降低,而海藻糖含量和蜕皮激素滴度无显著差异。上述结果说明On In R1是典型的胰岛素受体基因,On In R2基因对明小花蝽的生殖发育也有一定的影响功能。
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