石蜡包埋组织中创伤弧菌检测的方法学探讨

作     者：黄邦军 

作者单位：海南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：翁阳

授予年度：2024年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：创伤弧菌 石蜡包埋组织 动物实验 qPCR 

摘      要：目的:1.探讨石蜡包埋组织中通过实时荧光定量PCR(q PCR)及普通PCR检测创伤弧菌感染的实验方法学;2.分析创伤弧菌通过消化道和皮肤伤口感染的病理学特征。 方法:将购于具有创伤弧菌保存资质单位的创伤弧菌标准菌株(ATCC27562,菌株编号1.1758)作为本实验的标准菌株,复苏后进行培养、鉴定,并提取DNA及进行小鼠实验。通过无菌操作建立动物模型,包括经口实验组、经口对照组、创伤实验组、创伤对照组,并连续观察24-48h,记录各组小鼠的一般情况,小鼠死亡或观察结束后断脊法立即进行重要脏器及局部创伤组织取材并固定,同时收集胃液及创伤处分泌物进行培养鉴定,组织脱水后制成组织蜡块后切片,进行HE染色,观察病理变化。所有蜡块都进行DNA提取,以标准创伤弧菌DNA作为阳性对照,探讨通过普通PCR及q PCR检测创伤弧菌的可行性,并通过临床实际病例进行验证。 结果:创伤弧菌在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长为圆形、扁平,中心不透明,边,缘透明的黄色菌落。革兰氏染色后,光镜下观察呈革兰氏染色阴性,呈杆状或弯曲呈弧状。动物实验结果显示经口实验组小鼠在喂食菌液后10h-12h全部死亡,而经口对照组小鼠观察过程中一般情况好,与实验前状态相仿。创伤组小鼠观察24-48h一般情况均尚可,创伤实验组小鼠主要表现为局部组织化脓性改变,创伤对照组小鼠局部伤口呈愈合之势。通过对小鼠进行规范化取材,制成组织蜡块并进行镜下观察发现实验组小鼠除了局部接触细菌的组织(如胃肠及伤口周围组织)损害外,主要病变脏器包括(肺、肝、肾等)也存在不同程度的病变,而对照组小鼠各器官未见明显病变。通过普通PCR及q PCR技术对所有组织蜡块进行鉴定,只有经口实验组的消化道组织(包括胃、肠组织)及创伤实验组的局部肌组织中均扩增出了与标准菌株相同的、预期大小相符合的目的条带(vvh A:519bp;16s r DNA B:839bp)以及q PCR扩增曲线。我们用上述相同的实验方法对临床送检的1例因下肢伤口接触污染海水或海产品导致创伤弧菌感染病例的局部清创组织进行实验,同样扩增出与标准菌株相同的PCR目的条带及q PCR扩增曲线。 结论:1.创伤弧菌可以通过消化道和伤口接触致病,通过病理学观察发现,创伤弧菌感染可导致急性胃肠炎、坏死性筋膜炎以及多器官功能损害。2.创伤弧菌经消化道或伤口感染导致多器官功能损害主要原因可能是细菌在局部繁殖并释放毒素入血导致的毒血症,而非细菌入血、繁殖导致的菌血症。3.本实验初步验证了实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织中创伤弧菌感染的可行性,为进一步确立创伤弧菌感染的病理学检测及诊断流程奠定基础。