葛根通过调节巨噬细胞自噬抗炎的药效物质基础及其机制研究

作     者：张业纲 

作者单位：长春中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗浩铭

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：葛根 巨噬细胞 自噬 芒柄花素 炎症 

摘      要：目的:炎症是一系列疾病发生和发展的重要原因,会对人的精神和身体健康造成了严重的负面影响。然而,目前常见的抗炎类药物阿莫西林、对乙酰基酚、阿西美辛、布洛芬等只能控制其表面症状,不良反应较多,长期服用可能造成器质性损伤。众多研究表明葛根具有较强的抗炎活性,但药效物质基础和作用机制还不完全清晰,对实际应用发展造成一定阻碍,因此,本实验对葛根抗炎的药效物质基础和分子机制进行探讨研究,为开发抗炎药物奠定基础。 方法:(1)采用硅胶柱层析等手段,对葛根化学成分进行提取、分离和纯化;(2)对RAW264.7细胞分泌的炎症因子IL-6,IL-1β的含量变化筛选葛根中有效改善炎症反应的各化学成分;(3)利用巨噬细胞转基因荧光斑马鱼评价芒柄花素对斑马鱼炎症部位巨噬细胞数量的影响;(4)CCK-8法检测芒柄花素和脂多糖对RAW264.7细胞活性的影响;(5)以IL-6、IL-1β、NO为检测指标,通过试剂盒检测芒柄花素作用于LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎药效活性;(6)利用网络药理学挖掘分析芒柄花素抗炎且与自噬和极化相关的靶点和通路,并建立LPS诱导的巨噬细胞体外炎症模型,用不同浓度的芒柄花素进行干预治疗,利用Wetern Blot和流式细胞术检测自噬标志物LC3Ⅱ、P62和极化标志物CD206、CD86的表达水平。 结果:(1)从葛根中共分离出16种化合物,其中6种化合物首次从葛根中分离得到,分别为:芥酸、3-(2 ,4 -dihydroxyphenyl)-4,7-dihydroxy-2H-1-benzopyran-2-one、二十三烷醇、十七烷酸、异巴尔三萜醇、4 ,7-二羟基高异黄酮;其他化合物为:(2S)-liquiritigenin、puerariafuran、芒柄花素、染料木黄酮、块葛黄酮、7,3 ,4 -三羟基异黄酮、6-O-acetyldaidzin、Daidzein、4 ,7-二羟基-3 -甲氧基异黄酮、β-谷甾醇;(2)对RAW264.7细胞分泌的IL-6和IL-1β进行含量检测发现芒柄花素能够明显降低其含量,说明芒柄花素是葛根抗炎的主要活性成分;(3)体外实验结果表明芒柄花素能够降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-1β、NO的浓度,减缓炎症反应;(4)利用芒柄花素处理巨噬细胞转基因荧光斑马鱼后发现,芒柄花素能够明显减少炎症部位巨噬细胞数量;(5)网络药理学分析发现芒柄花素与炎症的共有靶蛋白与自噬和极化相关,并通过Wetern Blot和流式细胞术检测,芒柄花素作用于LPS诱导的巨噬细胞后,自噬标志物LC3Ⅱ表达升高、P62表达降低和极化标志物CD206表达升高、CD86表达降低。 结论:芒柄花素可作为抗炎的主要活性成分。通过对RAW264.7细胞炎症模型的构建,芒柄花素能够促进巨噬细胞自噬,调节极化蛋白的表达,发挥抗炎作用。