异甘草素对金黄色葡萄球菌活性及其毒力因子α-溶血素的作用研究

作     者：徐凤岐 

作者单位：湖北医药学院 

学位级别：硕士

导师姓名：唐以军

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：金黄色葡萄球菌 α-溶血素 异甘草素 抗毒力治疗 

摘      要：背景:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种条件致病菌,广泛存在于自然界中,当机体免疫力下降时,可通过吸入感染或血行感染等方式引起金黄色葡萄球菌肺炎。金葡菌进入肺部后,可通过分泌各种不同的毒力因子造成肺部损伤,病死率较高。其中α-溶血素是金葡菌毒力因子中公认致病力最强的一种,在金葡菌感染中发挥重要作用。临床上常使用抗生素治疗金葡菌肺炎,但由于抗生素的滥用造成了细菌耐药,治疗效果大打折扣,因此迫切需要寻求新的治疗策略来防治金葡菌感染,减少金葡菌耐药性产生。抗毒力策略是目前抗生素替代治疗中较为热门的治疗方法,α-溶血素是热门的抗毒力靶标之一。异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是一种从甘草植物根中提取到的黄酮类活性单体,具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、抗菌等多种作用。但目前尚无关于异甘草素对金葡菌活性及其毒力因子α-溶血素作用的文献报道。 目的:本研究旨在探究异甘草素对金葡菌活性及其毒力因子α-溶血素的作用。以此来探讨异甘草素在金葡菌感染抗毒力治疗中的作用,为临床抗金葡菌感染提供新的思路。 方法:本研究以金葡菌ATCC 29213为实验菌株,使用微量肉汤稀释法测算异甘草素对金葡菌生长的最小抑菌浓度(MIC值),通过琼脂扩散实验及绘制金葡菌时间-生长曲线进一步评估异甘草素对金葡菌的抑菌作用。通过溶血实验评估异甘草素对金葡菌α-溶血素溶血活性的影响,通过中和实验、Western Blot实验探究异甘草素抑制金葡菌α-溶血素溶血活性的作用机制。利用A549细胞构建金葡菌感染体外模型,使用活死细胞染色法,通过细胞荧光实验探究异甘草素对金葡菌α-溶血素引起的细胞损伤的保护作用。 结果:1.通过微量肉汤稀释法测得异甘草素对5株金葡菌临床菌株MICs范围为25-50μg/ml,对金葡菌标准株ATCC 29213 MIC值为50μg/ml。在琼脂扩散实验中,与正常对照组相比,药物1MIC组金葡菌生长完全受到抑制。通过绘制金葡菌时间-生长曲线发现,与正常对照组相比,亚抑菌浓度(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)下的异甘草素可延缓金葡菌生长,但不能完全抑制金葡菌生长;当异甘草素浓度为最小抑菌浓度即50μg/ml时,可完全抑制金葡菌生长。 2.(1)溶血试验表明,以0μg/ml溶血率100%为阳性对照,DMSO、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml组溶血率分别为97.69%(P0.05),89.71%(P0.05),62.67%(P0.05)。(3)Western Blot实验表明随着异甘草素浓度梯度升高,α-溶血素表达量逐渐下降;当异甘草素浓度为20μg/ml时,α-溶血素表达量降低约2倍(P0.05)。荧光染色发现,与Control组相比,金葡菌模型组A549细胞感染后大量死亡;当在共培养体系中加入异甘草素后,A549细胞损伤程度较模型组明显减轻,死亡数量明显减少;当异甘草素浓度为20μg/ml时能够显著抑制金葡菌引起的细胞损伤,A549细胞无明显死亡,与Control组无明显差异。 结论:1.异甘草素对金葡菌有较好的抑菌活性,对5株金葡菌临床分离菌株的M ICs范围为25-50μg/ml,对金葡菌标准株ATCC 29213的MIC值为50μg/ml。 2.异甘草素有较好的抗金葡菌α-溶血素溶血活性,但不能直接拮抗α-溶血素,可通过抑制α-溶血素表达来抑制其溶血活性。当异甘草素浓度为20μg/ml时,几乎可以完全抑制金葡菌溶血。 3.异甘草素可以减轻金葡菌α-溶血素引起的A549细胞损伤。