不同等级龙胆的质量表征及活性研究

作     者：寇柏鑫 

作者单位：长春中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：翁丽丽

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：龙胆 等级 显微 化学成分 肝损伤 

摘      要：目的:龙胆主产于东北三省,是清热燥湿、泻肝胆火的要药,基于课题组前期国家中药标准化项目（龙胆等级标准研究）,在表观性状、理化指标划分龙胆等级的基础上,通过偏光显微镜、电镜、拉曼特征光谱及液质,进一步明确不同等级龙胆显微特征及化学成分差异;并分别建立体外氧化损伤细胞模型和体内急性肝损伤小鼠模型,结合生物效价方法,评价不同等级龙胆的生物活性差异,旨在通过显微特征评价、多成分评价、生物活性评价多角度诠释不同等级龙胆商品的差异,建立表观性状、微观显微特征、活性成分和生物活性一体化的龙胆等级评价方法,为龙胆优质中药材的筛选及整体的质量控制与质量评价方法的建立奠定基础。 方法:（1）利用偏光显微镜、扫描电子显微镜和激光显微拉曼光谱仪,分别对龙胆粉末中的草酸钙针晶数目、面积进行测定,对龙胆横切面形貌进行观测,结合化学计量学方法对龙胆粉末中的草酸钙针晶的拉曼特征光谱进行分析;（2）液相色谱-质谱法联用测定龙胆一等品和二等品化学成分,采用LC-MS solution软件,Simca 14.1软件对结果进行分析,探索影响龙胆质量的差异成分;（3）建立H2O2诱导的氧化损伤Hep G2细胞模型,采用CCK-8法、ELISA法及生物化学方法对比不同等级龙胆对细胞活力、肝功能指标、氧化应激指标及炎症因子的影响,以VC为参照物,利用生物效价评定二者抗氧化活力;（4）采用ELISA、生物化学方法、实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）法及蛋白质印迹法（WB）测定0.3%的CCl4橄榄油溶液诱导的急性肝损伤模型小鼠的肝功能、氧化应激酶活性、炎症因子水平及相关基因、蛋白表达量。 结果:（1）与龙胆二等品相比,龙胆一等品具有面积更大、数目更多的草酸钙针晶（P0.01）,龙胆一等品的根茎更加发达,导管孔径更大（P0.01）,建立了36批龙胆中草酸钙针晶的拉曼特征光谱（一等、二等各18批）,且在273、304、415、570 cm-1波长下龙胆一等品和二等品拉曼光强差异显著（P0.01）;（2）共解析出53种成分,龙胆一等品和二等品成分种类相同,其中46种成分在龙胆一等品中有更高的含量,且Euphorbiaceae C、Loganetin、gentianoside、Swertiamarin等环烯醚萜类成分在二者中含量差异显著;（3）龙胆一等品对H2O2作用下的Hep G2细胞抑制炎症因子及提升抗SOD、CAT等氧化酶活性强于龙胆二等品（P0.05）,而二者在降低AST活性方面差异不显著。建立了龙胆的生物效价评价方法,效价与龙胆苦苷含量相关性方程为y=0.0032x+3.1384（R=0.9901）,精密度、中间精密度、重复性、可靠性考察均符合要求。采用氧化生物效价检测方法,评价不同等级龙胆药材的生物质量,龙胆一等品药材平均效价明显高于龙胆二等品;（4）龙胆一等品与二等品均有保肝作用,但与二等品相比,一等品对CCl4诱导的急性肝损伤C57BL/6小鼠的体重减轻、肝脾指数增加、肝小叶结构和肝细胞状态异常、胶原沉积的抑制作用更强,提升SOD、CAT水平,降低ALT、AST、IL-1、IL-6水平更显著（P0.05）,提升Nrf2、HO-1 m RNA表达水平（P0.05）,降低Fas、TLR4、ERK m RNA表达水平（P0.05）更显著,提高Nrf2、HO-1及IKBα等相关蛋白表达,降低TLR4蛋白表达的效果（P0.05）更显著,但对于FXR m RNA表达水平方面龙胆一等品与二等品之间差异不显著。 结论:本研究建立了龙胆等级的显微评价方法,从光镜、电镜、光谱等角度发现龙胆一等品中草酸钙针晶数目更多,面积更大,拉曼光强更大;从化学成分角度发现Euphorbiaceae C、Loganetin、gentianoside、Swertiamarin等成分可作为区分龙胆等级的含量差异成分;从体外抗氧化生物效价和体内抗急性肝损伤研究发现龙胆一等品在抗炎和抗氧化作用方面更强。研究结果将为其他类似中药材等级评价、优质药材筛选及临床合理用药提供理论依据。