适宜浓度尿酸通过Nrf2信号通路在缺血性心脏病中的作用及机制研究

作     者：马鹏强 

作者单位：湖北医药学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李飞峰

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：尿酸 缺血性心脏病 氧化应激 Nrf2信号通路 ML385 

摘      要：背景:缺血性心脏病（Ischemic Heart Disease,IHD）是一种对人类健康构成严重威胁的疾病。它主要是由血管壁损伤、氧化应激和炎症反应所引发的冠状动脉硬化病变,导致动脉粥样硬化斑块的形成,从而引发梗阻或狭窄所引起的一系列疾病。尿酸（Uric acid,UA）作为心脑血管疾病的生物标志物,可能增加心血管的氧化应激风险,然而也可能作为抗氧化剂提供一定程度的保护。关于UA在IHD致病性中的作用,目前仍存在许多争议,其具体作用机制还不完全清楚。在心血管疾病中,Nrf2信号通路是细胞抵抗氧化应激的中枢调节者,其作用越来越受到研究人员的关注。UA有可能通过激活Nrf2信号通路对心血管系统产生保护作用,从而减轻心肌细胞的氧化应激损伤。在本研究中,通过人群研究和体外实验,阐述了UA通过Nrf2信号通路对IHD的保护性作用和机制。 目的:旨在通过观察UA对IHD患者的作用,以及H2O2诱导的H9C2心肌细胞氧化应激模型的影响,以深入了解UA对IHD的具体作用及背后的机制。 方法:（1）人群流行病学调查分析:选择2015年至2020年在十堰市某大型三级甲等综合性医院常规体检人群缺血性心脏病患者（以心电图缺血性改变作为判断标准）作为研究组,同时选择了同期心电图正常的体检人群作为对照组。对研究对象进行了详细的基础调查,采集空腹静脉血,检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、尿素氮、肌酐、UA、总胆固醇、甘油三酯等生化指标,以及检测空腹血糖,测量血压等。使用logistic回归和Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）检验分析UA水平与IHD之间的关联。 （2）体外细胞实验:利用H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞氧化应激模型,研究UA在H2O2暴露下对心肌细胞的保护作用和机制。细胞活力用CCK-8法测定,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放用比色法检测,以反映细胞损伤。为反映氧化应激水平,通过ABTS法和FRAP法测定总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）,使用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生。为了阐明这一机制,采用蛋白质印迹法检测了与Nrf2信号通路相关的蛋白,如Nrf2、Keap1、GCLC和HO-1蛋白表达情况。为反映细胞的生长特性,检测细胞周期、集落形成、划痕实验和血管生成。为进一步了解UA的靶向作用,使用Nrf2抑制剂ML385,观察Nrf2信号通路抑制后的相关氧化应激水平和Nrf2信号通路相关蛋白表达的变化。 结果:（1）本研究共纳入29630人,IHD组775人,心电图正常组（EN）28855人。从2015年～2020年,IHD的患病率整体呈现下降的趋势,女性的IHD患病率明显高于男性(6.94%vs.1.80%,P=1.598×10-91),IHD患病率随着年龄的增长而增长。与此相反,UA水平呈现出逐年上升的趋势,男性的平均UA水平明显高于女性（389.41μmol/L vs.281.71μmol/L,P0.001）。此外,高尿酸的情况呈现出年轻化的态势,表现为青年人的尿酸高于中老年人群。IHD患者的UA水平明显低于正常人群。多因素logistic回归分析显示,随着UA水平的降低,OR值小于1且逐渐降低,IHD发生风险逐渐降低,具体为UA＿Q1（OR=0.723,95%CI:0.566～0.925）、UA＿Q2（OR=0.772,95%CI:0.608～0.980）、UA＿Q3（OR=0.779,95%CI:0.610～0.996）。CMH检验也显示出不同性别、年龄阶段的UA水平与IHD患病率相关性研究结果显示,正常范围内UA水平与IHD患病率呈负相关。 （2）尿酸浓度处于11.9–594.8μmol/L时,轻度促进H9C2细胞增殖,而高浓度UA时则抑制细胞增殖。氧化应激细胞模型建立后,观察到细胞活力明显下降,LDH和ROS水平都有所上升,同时细胞周期阻滞在G1期,细胞集落形成能力、伤口愈合能力和血管形成能力明显减弱。相较于模型组,当给予UA处理后,UA浓度达到237.9μmol/L时,H9C2细胞活力最强,与模型组存在明显统计学差异。因此选择237.9μmol/L作为后续实验浓度。经过UA处理后,上述模型组的损伤指标发生显著逆转,同时Nrf2和下游抗氧化蛋白的表达水平明显提高。对尿酸+H2O2组给予Nrf2抑制剂ML385处理后,Nrf2信号通路蛋白表达明显被抑制,H9C2细胞活力下降,ROS水平上升,T-AOC降低,细胞周期阻滞,集落形成能力、伤口愈合能力、血管形成能力下降。 结论:正常范围内UA水平与IHD的发生呈负相关,通过诱导Nrf2信号通