基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨生脉散对气阴两虚型失眠小鼠的作用及机制研究

作     者：李典育 

作者单位：长春中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李娜

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：生脉散 失眠 气阴两虚证 cAMP/PKA/CREB信号通路 

摘      要：目的:在传统中医理论指导下,基于生信分析以及cAMP/PKA/CREB信号通路,分析探讨生脉散（SMS）对气阴两虚型失眠的防治作用。从分子水平阐述SMS防治气阴两虚型失眠的作用机制,为其临床应用提供科学依据。 方法: 1、首先进行SMS中药活性成分与对应的靶点基因信息的筛选,并收集气阴两虚型失眠相关靶点基因。然后绘制SMS药物靶点与气阴两虚型失眠靶点的交集韦恩图,并绘制药物-有效成分-靶点-疾病网络图。接下来构建蛋白质相互作用（PPI）网络图,并对SMS与气阴两虚型失眠的共有靶点进行GO富集分析以及KEGG通路富集分析,预测可能的作用通路。 2、通过采用“燥热之品伤阴、限食、负重游泳法以及腹腔注射L-4氯苯丙氨酸多因素造模法建立小鼠气阴两虚型失眠模型。观察记录小鼠状态并绘制生长曲线;通过翻正实验量化小鼠睡眠情况;通过Morris水迷宫实验量化小鼠健忘情况;通过旷场试验量化小鼠自主活动情况;通过抓力及负重游泳实验量化气虚情况;通过面温、爪温、肛温及热成像实验量化五心烦热情况;通过出血实验量化气阴两虚夹瘀情况;通过以上实验验证SMS的益气、养阴、安神作用,并证实SMS防治气阴两虚型失眠的功效。 3、通过病理学检测观察小鼠脑组织的形态学改变;通过Elisa试剂盒检测小鼠脑组织中5-HT、NE、DA的含量来判断小鼠的睡眠情况;通过检测血清中cAMP、c GMP含量来判断阴虚变化情况;通过NK细胞杀伤实验和淋巴细胞转化实验及检测小鼠脾脏中CD4+、CD8+含量判断小鼠的气虚情况及免疫功能;通过检测小鼠血液中APTT及PT含量的变化判断血瘀情况;通过Western blot检测cAMP/PKA/CREB信号通路上相关蛋白表达水平。 结果: 1、经生信分析预测出SMS中潜在活性成分有30种,涉及基因靶点1724个,其中核心靶点包括AKT1、CREB1、STAT3等,涉及的通路包括PI3K/AKT信号通路、cAMP信号通路、JAK/STAT3信号通路等。 2、在表征检测中发现,SMS可以缩短小鼠的睡眠潜伏期,延长小鼠的睡眠时间（P0.05）;缩短Morris水迷宫实验中小鼠上岸潜伏期及总路程（P0.05）,增加进入平台次数（P0.05）;延长旷场实验中小鼠移动总路程、平均速度及中央区停留时间（P0.05）;增加小鼠抓力（P0.05）及延长负重游泳时间（P0.05）;降低小鼠面温、爪温及肛温;延长小鼠出血时间（P0.05）;增加小鼠舌象分析中的RGB值。 3、在机制研究中发现,SMS可以增加脑中5-HT含量（P0.05）,减少脑中NE、DA含量（P0.05）;增加NK细胞杀伤率及淋巴细胞刺激指数（P0.05）,增加脾脏中CD4+水平及CD4+/CD8+比值（P0.05）;减少血清中cAMP含量及cAMP/c GMP比值（P0.05）;增加血浆中APTT与PT含量（P0.05）;促进cAMP、PKA、CREB以及BDNF蛋白的表达（P0.05）。结果表明SMS可能是通过脑中神经递质的改变从而影响cAMP/PKA/CREB信号通路中相关蛋白的表达,从而改善气阴两虚型失眠小鼠的睡眠情况,证实SMS具有防治气阴两虚型失眠的功效。 结论:本文首先通过生信分析预测了SMS防治气阴两虚型失眠的作用及可能作用的关键靶点及通路。其次,对SMS防治气阴两虚型失眠的作用进行了表征药效学研究,证实了SMS益气、养阴、安神的药效作用以及防治气阴两虚型失眠的功效。最后,对SMS防治气阴两虚型失眠的作用机制进行探讨,证明了SMS可通过多成分以及多靶点协同发挥防治气阴两虚的作用,其机制可能是通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路产生作用。此研究为SMS在中医临床应用提供了科学参考。