柑橘全爪螨神经酰胺合成酶基因的鉴定与功能研究

作     者：张宵菁 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：辛天蓉

授予年度：2024年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：柑橘全爪螨 神经酰胺合成酶 分子特性 生殖 脂质组学 

摘      要：柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)又名柑橘红蜘蛛,被认为是严重为害柑橘的世界性害螨,主要以成螨、若螨和幼螨刺吸叶片、绿色嫩梢及果实等的汁液,从而严重影响柑橘和脐橙等经济作物的产量和品质。由于该螨螨体小、繁殖力强、发育历期短、世代交替严重等导致其田间防控难度增加。当前化学防治仍然是其重要的防治手段,但杀虫剂的不合理使用使其产生严重的抗药性,已经严重制约着柑橘脐橙产业的健康发展和害虫(螨)的可持续控制。因此,开展害虫抗药性治理,寻找新型高效杀虫剂的靶标成为当前生物农药研发的热点。神经酰胺作为鞘脂代谢的中心,是真核生物细胞膜和细胞信号传递中的重要组分,在细胞增殖、细胞凋亡及细胞分化等细胞代谢中发挥重要的生物学作用。神经酰胺合成酶(Ceramide synthase)在神经酰胺的从头合成途径中起关键作用。目前并未见到神经酰胺合成酶基因参与柑橘全爪螨雌成螨的发育和生殖功能的研究报道。因此,本文以柑橘全爪螨为研究对象,采用RTPCR结合RACE技术克隆获得该螨神经酰胺合成酶基因的全长,并对其生长发育不同阶段的表达模式进行分析;利用RNA干扰技术对该基因的生物学功能进行全面分析并从脂质组学水平上深入探究该基因介导的脂质代谢的分子机制。主要的研究结果如下: 1、首次克隆获得柑橘全爪螨神经酰胺合成酶PcCerS的全长(Gen Bank登录号:PP411977),其cDNA序列为1373bp,开放阅读框为1065bp,编码354个氨基酸,推导的蛋白质的分子质量和理论等电点PI分别为41.652KDa和8.12,并含有一个糖基化位点。PcCerS含有3个保守的结构域:TLC结构域、HOX结构域和[K/R]-P-X-X-X-X-[K/R]-F基序。氨基酸序列比对的结果表明柑橘全爪螨PcCerS与二斑叶螨、地里恙螨和安氏革蜱CerS的相似度分别为82.77%、63.07%和53.03%。采用邻接法基于PcCerS编码的氨基酸序列进行系统发育树的构建,结果显示,系统发育树聚类明显,分为三大支,分别为昆虫纲、蛛形纲和哺乳纲;其中,柑橘全爪螨与二斑叶螨的亲缘关系最近。接下来采用RT-qPCR技术对PcCerS在柑橘全爪螨生长发育不同阶段的mRNA表达水平进行检测,结果发现该基因在柑橘全爪螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、前若螨、后若螨、雌成螨、雄成螨)均表达;在雌成螨的表达量最高,在幼螨中的表达量最低。这表明以神经酰胺为代表的鞘脂类物质的代谢在成虫期更活跃,且有可能参与柑橘全爪螨的发育和生殖过程。 2、为进一步探究神经酰胺合成酶基因在柑橘全爪螨雌成螨的发育和生殖中的生物学功能,本文采用饲喂法导入dsRNA的RNA干扰技术对雌成螨进行PcCerS的沉默,全面分析了柑橘全爪螨雌成螨的生长发育、繁殖和细胞凋亡情况。在生长发育方面,RT-qPCR结果显示,与对照组相比,当dsRNA的浓度为2000ng/uL、2500ng/uL、3000ng/uL时,PcCerS的相对表达量分别为对照组的0.81倍、0.75倍和0.73倍,并且雌成螨的死亡率分别为28%、41%和54%(P0.05)。在dsRNA浓度为2000ng/uL时,对雌成螨进行不同时间(24h、48h、72h)的处理,结果发现机体PcCerS的相对表达量分别为对照组的0.81倍、0.6倍、0.89倍,并且雌成螨的存活率显著降低23%、35%和50%(P0.05)。在柑橘全爪螨雌成螨的繁殖方面,与对照组相比,沉默PcCerS后雌成螨的螨体缩小并发生皱缩、4对足明显缩短,最终死亡。对雌成螨的繁殖情况进行分析,结果表明:与对照组相比,PcCerS沉默显著降低了柑橘全爪螨雌成螨的产卵量和存活率,并且产下的卵的孵化率也显著下降(P0.05)。通过石蜡切片对雌成螨的卵巢形态进行观察,发现与对照组相比,PcCerS沉默后的卵巢畸形并缩小,卵子的数量明显减少。进一步采用RT-qPCR方法检测了雌成螨体内与生殖相关的关键基因卵黄原蛋白(Vg)及其受体(Vg R)基因的转录水平,结果发现敲除PcCerS后,Vg及Vg R基因的表达水平均显著降低(P0.05)。24h、48h、72h时,Vg基因的表达量与对照组相比分别降低了49%、62%和50%;Vg R基因的表达量与对照组相比分别降低了28%、42%和32%(P0.05)。最后检测了柑橘全爪螨雌成螨机体细胞凋亡情况,与对照组相比,Caspase3蛋白的相对含量显著升高且该基因的相对表达量为对照组的2.175倍,而SOD蛋白的相对含量却显著降低且该基因的表达量仅为对照组的0.36倍(P0.05),表明柑橘全爪螨机体出现细胞凋亡。综合以上结果,我们推测,沉默PcCerS会阻断柑橘全爪螨雌成螨机体内神经酰胺的合成,造成机体细胞发生凋亡反应,抑