玉米赤霉烯酮和3-氯-1,2丙二醇单克隆抗体的制备及其免疫层析试纸条的研发

作     者：桂贇 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张存政;李响敏;凌睿

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 081702[工学-化学工艺] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 

主      题：玉米赤霉烯酮 3-氯-1,2丙二醇 单克隆抗体 多重免疫层析 

摘      要：食用植物油中的真菌毒素,以及加工过程中产生的氯丙醇类污染物是影响食用安全的重要风险因子,严重危害人们的生命健康。其中,以玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）、3-氯-1,2丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol,3-MCPD）在食用植物油中污染广泛。ZEN是一种雌激素样的真菌毒素,误食会对哺乳动物生殖系统产生不良影响,诱发雌性激素综合征;而3-MCPD是食品加工过程中产生的氯丙醇类污染物,长期摄入会对肾脏、生殖系统产生不良影响,提高人体潜在的癌变率。因此,快速检测与鉴定食用植物油中此两种污染物的残留情况,对保障人们的健康安全意义重大。以免疫层析方法（Lateral flow immunoassay,LFIA）制备的产品由于具有便携、低成本、操作简便和能够长期保存等优势,逐渐成为食品安全快速筛查领域的首选工具,但目前尚无3-MCPD免疫学检测方法的报道,而高质量抗体的是开发免疫层析方法的核心。因此,本研究设计、合成了ZEN和3-MCPD半抗原,利用杂交瘤技术获得了高特异性的单克隆抗体,建立了基于聚集诱导发光微球（Aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFMs）的多重免疫层析检测方法,首次实现了对玉米油中ZEN和3-MCPD的免疫学方法的同时检测,主要研究结果如下: （1）半抗原的设计与合成。针对ZEN进行羧基化修饰得到ZEN半抗原;针对3-MCPD进行衍生,引入含单个苯环结构的连接臂得到3-MCPD半抗原。使用薄层色谱法和质谱进一步鉴定,表明成功获得ZEN和3-MCPD半抗原。将成功制备的半抗原,分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联,使用紫外分光光度法进行鉴定,得到人工全抗原。 （2）单克隆抗体的制备与鉴定。经小鼠免疫、细胞融合和亚克隆等过程,成功筛选到分泌ZEN抗体的1-8F-G4-H2、1-D10-B11-F10和5-H2-C9-C9细胞株;分泌高特异性识别3-MCPD半抗原抗体的2-5F-H6-E3、3-4G-D10-C10细胞株。抗体性质鉴定表明:5株单克隆抗体均为Ig G1型;其中抗ZEN的单克隆抗体,在最佳工作浓度下,1-8F-G4-H2、1-D10-B11-F10、5-H2-C9-C9的IC50分别为0.51 ng/m L,6.90 ng/m L和0.72 ng/m L,与α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇交叉反应率分别为87.18%,64.31%、18.87%、4.28%,与其他真菌毒素无明显交叉;抗3-MCPD半抗原的单克隆抗体在最佳工作浓度下,2-5F-H6-E3、3-4G-D10-C10的IC50分别为45.66 ng/m L、55.85 ng/m L,与衍生剂4-氨甲基苯甲酸和3-MCPD及其结构类似物无明显的交叉反应。选取单克隆抗体1-8F-G4-H2、2-5F-H6-E3进行AIEFMs多重检测免疫层析方法（AIEFMs-LFIA）研发。 （3）基于AIEFMs标记的多重免疫层析检测方法研究。以激发波长365 nm、发射600 nm的AIEFMs作为标记探针偶联抗体,构建了基于AIEFMs标记的检测3-MCPD和ZEN的多重免疫层析方法。在最佳实验条件下,所建立的AIEFMs-LFIA对3-MCPD衍生物的IC50为6.03 ng/m L,线性范围(IC20-80)为2.26～20.94ng/m L;对ZEN的IC50为1.14 ng/m L,线性范围(IC20-80)为0.43～4.23 ng/m L。选用玉米油为添加样进行方法验证,使用建立的AIEFMs-LFIA进行检测,根据3-MCPD衍生率计算得出加标回收率为75.2～88.5%,变异系数为6.5～10.2%;ZEN加标回收率为81.2～90.3%,变异系数为7.4～9.6%。所建立的AIEFMs-LFIA方法与LC-MS/MS检测结果具有较好的一致性,方法可靠性。 本项研究通过设计合成了ZEN和3-MCPD半抗原,获得了高特异性的单克隆抗体,所建立的AIEFMs-LFIA方法实现了对玉米油中3-MCPD和ZEN的检测,具有较高的应用潜力。