酶解协同膜分离技术消减乳蛋白致敏性及低敏乳清粉的实验室扩大制备

作     者：谭水杰 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李欣;刘学铭

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：牛乳过敏 酶解技术 膜分离技术 小鼠过敏模型 低敏乳清粉 

摘      要：牛乳过敏是最常见的食物过敏之一,严重影响人们的生活质量。在我国,有2.69%的婴幼儿对牛乳蛋白过敏。而牛乳蛋白是婴幼儿主要的食物蛋白来源,避食会影响他们的生长发育。因此,低致敏乳品的研究与开发备受医学界和营养学界的关注。研究发现,生物酶法是目前降低牛奶蛋白致敏性最主要的方法,但单一的酶解技术存在随机性强和酶解不彻底等缺陷,需要进一步改善以提高酶解效果。膜分离技术条件温和、操作方便,可以有效去除酶解不彻底的大分子肽段。将酶解技术与膜过滤技术结合,对乳蛋白酶解产物进行分级分离,以获得品质良好的低致敏乳蛋白,对于低敏乳品的开发具有重大意义。本研究以牛乳乳清蛋白和酪蛋白为研究对象,采用酶解和膜分离技术降低其致敏性,并通过BALB/c小鼠过敏模型评估酶解协同膜分离技术处理后的乳清蛋白和酪蛋白致敏性。同时,建立了低敏乳清粉的实验室扩大制备工艺设计,以获得品质良好的低敏乳清粉产品。主要的研究方法、结果和结论如下: 1、通过离子交换层析和凝胶过滤层析技术成功制备了牛乳主要过敏原β-乳球蛋白、α-乳白蛋白以及αs1-酪蛋白,其中BLG、ALA和αs1-CN的纯度分别为92.3%、93.7%和90.6%,得率分别为68.1%、20.5%和32.6%。同时优化了离子交换层析分离纯化乳清蛋白的洗脱条件,采用以0.1-0.4 M Na Cl浓度的洗脱液进行线性洗脱,色谱图对应的BLG和ALA洗脱峰分隔更开,得率更高,BLG和ALA的得率分别提升至73.6%和25.8%。还优化了离子交换层析分离纯化乳清蛋白的洗脱方式,先采用0.17 M Na Cl浓度的洗脱液,再采用0.3 M Na Cl浓度的洗脱液进行分步洗脱,BLG和ALA分离效果更好,纯度更高,BLG和ALA的纯度分别提升至97.5%和96.1%。 2、基于特异性抗体结合能力,对碱性蛋白酶水解乳清蛋白的条件进行优化,得到最佳酶解条件为:E/S=2%、t=3 h、T=50℃、p H=10;对碱性蛋白酶水解酪蛋白的条件进行优化,得到最佳酶解条件为:E/S=2.0%、t=4 h、T=55℃、p H=10。基于市售低致敏奶粉分类中对应的分子量,采用膜分离技术对水解乳清蛋白和水解酪蛋白溶液进行分离,得到的3-10 k Da和3 k Da酶解液组分抗原性均显著下降。与未处理的水解乳清蛋白和水解酪蛋白相比,3-10 k Da HWP组分ALA与Ig G的结合能力最弱,下降到原来的1/434;3 k Da HWP组分BLG与Ig G结合能力最弱,下降到原来的1/1536;3 k Da HCN组分αs1-CN与Ig G的结合能力最弱,下降到原来的1/3。 3、基于小鼠过敏模型,对乳清蛋白和酪蛋白及其酶解-膜过滤产物进行体内致敏性评估。在体液免疫方面,与乳清蛋白和酪蛋白致敏组相比,酶解-膜过滤组特异性抗体水平均显著下降,表明乳清蛋白和酪蛋白酶解-膜过滤产物可抑制小鼠体液免疫朝Th2方向偏移,调控机体Th2/Th1平衡。在细胞免疫方面,与致敏组相比,酶解-膜过滤组脾脏中Th2型细胞因子分泌水平均显著降低,3 k Da HWP组促进了脾脏中Th1和Treg型细胞的分化,降低了MLN中CD40的表达;3-10k Da HCN组脾脏和MLN中Th2型细胞分化减少,CD86表达减少。表明乳清蛋白和酪蛋白酶解-膜过滤产物可从细胞免疫方向调控机体的免疫分化。 4、通过实验室放大生产工艺制备了168 g低敏乳清粉产品,得率为37.3%,蛋白含量为79.41%,必需氨基酸含量为36.83%,具有较高的营养价值。制备的低敏乳清粉产品的抗原性介于部分水解奶粉和深度水解奶粉之间,对于低致敏配方乳粉的生产具有一定的现实意义。