抗Cry1Ac纳米抗体的亲和改造及其在电化学发光免疫传感器中的应用

作     者：欧阳惺 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：付金衡;王丹

授予年度：2024年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 08[工学] 080202[工学-机械电子工程] 0802[工学-机械工程] 0836[工学-生物工程] 

主      题：纳米抗体 Cry1Ac 纳米抗体筛选 亲和力成熟 非标记电化学发光免疫传感器 

摘      要：纳米抗体具有尺寸小、可溶性好、稳定性好、易于生产和改造等优点,在免疫分析中展现出一定的应用前景。然而,天然库来源的纳米抗体通常亲和力较低,这导致在非标记免疫分析检测模式中存在特异性不好的问题。本研究在从天然文库中获取抗Cry1Ac纳米抗体的基础上,通过随机突变来提高该纳米抗体的亲和力,进一步将亲和力提高的纳米抗体突变体应用于非标记电化学发光免疫传感器。研究发现,亲和力提高的纳米抗体表现出较好的特异性和结合效力,这为非标记电化学发光免疫传感器的研究提供一定的方法学借鉴。主要研究内容如下: 1、以Cry1Ac为靶标,从天然纳米抗体文库中筛选抗Cry1Ac纳米抗体,经过4轮固相筛选,最后获得4条纳米抗体独特序列。综合氨基酸序列分析、重复验证、特异性检验的结果,选择将4-4序列作为原始抗体的DNA序列。诱导表达其对应的纳米抗体Nb-44,检测其特异性及结合活性,Nb-44表现出较好的性能,可以用于后续亲和力成熟。 2、以Nb-44的DNA序列为模板,采用易错PCR引入随机突变,成功构建库容量为2.84×10～8cfu的突变文库。以Cry1Ac为靶标,通过控制靶标包被浓度、孵育时间和洗涤次数等条件来富集亲和力提高的突变体。结合Phage-ELISA和生物信息学对突变体进行筛选,随后对筛选得到的突变纳米抗体进行表达,比较原始抗体和突变抗体的效价并进行亲和力表征,结果表明突变体Nb-44-355亲和力提高了4.5倍。 3、将纳米抗体Nb-44-355表达纯化后用于构建非标记电化学发光免疫传感器,以CNNS/PEI/Ru3+为基底材料,通过Ru3+与纳米抗体C端His标签的配位作用,将抗Cry1Ac纳米抗体固定于GCE电极表面。利用抗Cry1Ac纳米抗体与Cry1Ac的特异性作用引起电化学发光信号变化来实现对Cry1Ac的检测。最后构建的非标记电化学发光免疫传感器具有较好的特异性和稳定性,检测Cry1Ac的线性范围为10～10～4pg/m L,LOD为5.89 pg/m L,加标回收率在94.9%～109.4%之间。