提高香兰素生物合成途径中儿茶酚氧甲基转移酶产物选择性的计算再设计

作     者：龙建雨 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭天伟

授予年度：2024年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：计算再设计 儿茶酚氧甲基转移酶 虚拟突变库 分子动力学模拟 酶产物选择性 

摘      要：香兰素作为一种重要的化工产品广泛应用于食品、医药和农业等领域。目前生物法从葡萄糖从头合成香兰素已经实现,但是途径中催化甲基转移反应的甲基转移酶的产物选择性、酶活性和热稳定性等性质不佳,并不能满足实际需求。在体内原儿茶酸到香兰素前体香草酸的转化效率很低,同时副产物异香草酸占比也较大。较低转化效率和较多的副产物导致香兰素的最终产量较低,难以达到工业化的要求。 在本文的工作中我们使用了一种高效的计算酶再设计策略来改造儿茶酚氧甲基转移酶(Catechol-O-Methyltransferase,COMT),目的是改善产物选择性的同时提高酶的活性和热稳定性。首先结合酶蛋白高精度的晶体结构,明确的反应机理和甲基转移过渡态,基于计算再设计方法构建了包含大量低能序列的虚拟突变序列文库,再结合高通量分子动力学模拟聚焦性质改善的突变体,最终得到了只包含10个突变体的聚焦文库。最后通过体外实验验证发现有8个突变体在产物选择性或者酶活等方面有不同程度的改善。 实验验证发现产物选择性改善最优的突变体(W143H/L198M)副产物异香草酸占比降低到5.31%,相比于野生型(24.64%)大幅改善,同时产香草酸酶活是野生型的1.29倍。通过计算再设计得到的性质改善的突变体有望提高体内原儿茶酸到香草酸的转化,进而提高香兰素的终产量。 对COMT进一步计算设计改造有望实现生物法从葡萄糖高产香兰素。本工作所采用的计算酶再设计策略同样能应用于其他结构和机理明确但选择性或酶活性等性质表现不佳的酶。