Stutzerimonas stutzeri PRE-2的N2O还原和呼吸过程

作     者：周嘉贤 

作者单位：广州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：洪义国

授予年度：2024年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：反硝化 N2O还原 电子供体 nos Z Stutzerimonas stutzeri PRE-2 

摘      要：一氧化二氮（N2O）是全球第三大温室效应气体,也是造成臭氧层破环的主要物质。但近一个世纪以来,大气中N2O浓度因人类活动而稳步上升。在氮生物地球化学循环中,由nos Z基因编码的N2O还原酶将N2O还原为N2,是迄今已知的N2O去除的唯一生物途径。具有nos Z基因的N2O还原微生物在环境中广泛存在,它们对于控制大气中N2O浓度至关重要。但目前对于N2O还原微生物的认识还非常有限,特别是对N2O还原菌的N2O还原机制还缺乏认知。本论文成功从珠江口沉积物中分离出一珠具有N2O还原能力的反硝化细菌PRE-2,进一步分析了菌株PRE-2的N2O还原能力和特性;其次,结合基因组测序结果,对菌株PRE-2的N2O还原机制进行了探究;最后,通过设置单因素影响实验,探究了不同环境因素对菌株PRE-2的N2O还原影响。本论文取得的主要结论如下: （1）利用微生物分离纯化技术从珠江口沉积物中分离出一珠具有N2O还原能力细菌,并对此菌株进行了种属鉴定。16S r RNA基因测序结果表明,该菌株与数据库中Stutzerimonas stutzeri strain APB-6（MH667647.1）的相似度最高,达到99.93%,初步确认该菌株为施氏假单胞菌（Stutzerimonas stutzeri）,并命名为Stutzerimonas stutzeri PRE-2。该菌株的菌落颜色呈现乳白色,形状为圆形,周围有明显晕环,圆形边缘整齐且较为湿润。通过透射电子显微镜观察,发现该菌株呈现线性多细胞排列,菌体呈杆状,有单端鞭毛。通过功能基因注释分析发现,菌株PRE-2参与生长代谢的基因丰度最高,具有较强的生长代谢和细胞增殖能力,并且仅能利用与葡萄糖相似的单糖,而不能利用多糖。基因组注释到菌株含有反硝化和异化硝酸盐还原两条完整的氮代谢通路,说明该菌株具有完全反硝化能力。 （2）通过生理生化实验和基因组的综合分析,表明菌株PRE-2能够以N2O作为电子受体呼吸获得生长代谢所需要的能量。在以N2O为唯一电子供体的培养中,发现PRE-2具有良好的N2O还原能力,且在N2O还原过程中伴随着菌体生长量的增加。大多数电子供体均能支持菌株PRE-2的N2O还原,其中乙酸钠、乳酸钠和琥珀酸钠作为电子供体支持N2O还原的效果较好。在乙酸钠为电子供体,培养温度为30℃的缺氧条件下,菌株PRE-2的N2O还原速率为17.93±0.43μmol·h-1,菌体OD600增长量为0.054±0.013。同时,电子供体和电子受体之间存在紧密的偶联关系。在乙酸钠和乳酸钠作为电子供体时,菌株PRE-2的生物利用效率分别为32.25%和31.17%。通过构建进化树,发现该菌株的nos基因簇（nos Z,nos R,nos D,nos F,nos L,nos Y）与nos Z-Ⅰ型菌株类似,因此该菌株属于典型的nos Z-Ⅰ型N2O还原菌。在菌株PRE-2的N2O还原过程中,通过还原电子供体产生的电子在电子传递链的传递,驱动ATP合成,为菌株生长提供能量。 （3）单因素实验结果表明,多种因素影响菌株PRE-2的N2O过程。在20℃至40℃范围内,温度升高能够促进PRE-2的N2O还原和生长。酸性条件（p H=5-6）不利于PRE-2的生长,且强烈抑制N2O的还原;而在碱性条件（p H=8-9）,菌株PRE-2的N2O还原能力和生长速度都有显著增强。在有氧条件下,虽然菌体的生长更快,但N2O还原会受到严重的抑制。在添加NO3-条件下,菌株PRE-2的N2O还原能力有所下降,但促进了菌株的生长;添加NH4+则对菌株PRE-2的N2O还原和菌体生长没有显著影响。重金属离子Cu2+和Ag+对菌株PRE-2的N2O还原都起到抑制作用,且Ag+比Cu2+有更强的抑制能力。 综上所述,拥有nos Z-Ⅰ型N2O还原酶的典型反硝化细菌Stutzerimonas stutzeri PRE-2具有较强的N2O还原能力,并且能利用N2O进行呼吸和生长。由于反硝化途径的高度模块化特征,nos Z-Ⅰ型N2O还原菌不仅可以消耗自身产生的N2O,还可以在合适的条件下消耗非反硝化生物或非生物途径产生的外部N2O,有效减少环境N2O的释放。本论文对菌株PRE-2的N2O呼吸作用过程和机制的分析,深化了对nos Z-Ⅰ型N2O还原菌的生态功能的认识,为进一步利用微生物控制N2O的排放提供了一定的理论基础。