肠肽酶CUB2结构域催化底物功能及其调节机制研究

作     者：宋秋月 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金震东

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：重组蛋白 突变 CUB2结构域 酶活 分子对接 冷冻电镜 结构解析 单颗粒 空间构像 模型 

摘      要：第一部分肠肽酶CUB2结构域在识别与结合底物中的作用 研究目的:肠肽酶(Enteropeptidase,EP)作为胰酶激活的上游关键分子,在胰腺炎的发病中起着极其重要的作用。因此课题前期对肠肽酶-底物复合物(EP-sub)结构进行了电镜结构解析,利用Alpha Fold2对模型进行优化,我们发现EP第二个CUB结构域(CUB2)可能与胰蛋白酶原存在结合,受限于分辨率较低,未能证实CUB2是否在识别、结合底物过程中发挥作用。本研究拟对CUB2结构域功能进行深入探究。 研究方法:利用蛋白质分子对接工具PDBe PISA对已有EP-sub模型进行分析,预测EP蛋白CUB2结构域与底物相互作用的氨基酸位点,将潜在关键位点突变为丙氨酸后,合成18种重组突变蛋白。研究采用SDS-PAGE及Native-PAGE电泳技术对处于不同状态下的wt EP(野生型肠肽酶)、mut EP(突变型肠肽酶)进行验证。使用胰蛋白酶将非激活态的单链野生型、突变型肠肽酶原(inactivated-wt/mut EP)转变为激活态的双链野生型、突变型肠肽酶(activated-wt/mut EP)后,利用酶活试剂盒对激活前后wt/mut EP进行活性验证、激活底物能力验证。同时设计实验合成CUB2截断体,对其生化特性及功能进行验证。 研究结果:利用计算机模拟分子互作,最终筛选出18个位于CUB2结构域的潜在关键氨基酸位点。SDS-PAGE及Native-PAGE电泳验证发现重组蛋白无异常,单链EP分子量约150 k D,经胰蛋白酶激活后可转化为双链形式。对突变蛋白进行酶活验证,结果显示CUB2结构域Y546A、D578A突变使蛋白自激活能力增强。部分mut-EP激活底物胰蛋白酶原的能力明显上升或下降,其中E574A突变使EP激活底物能力明显上升,P547A、D578A和N619A突变则使EP激活底物能力显著下降。截断体实验证明,CUB2结构域具有识别、结合底物的能力,可能是介导EP水解底物的必需功能单元。 研究结论:CUB2是EP识别、结合底物的关键结构域,其中547位脯氨酸、574位谷氨酸、619位天冬酰胺及578位天冬氨酸是影响EP识别、结合底物胰蛋白酶原的关键位点,可在结构层面探究该位点影响底物识别的机制。 第二部分肠肽酶及其CUB2突变体电镜三维结构解析 研究目的:从结构层面揭示EP重链结合、催化底物的结构机制,探究CUB2结构域与胰蛋白酶原的作用模式,解析重链LCM结构域,并对其功能进行阐述。 研究方法:将activated-wt EP、activated-mut EP与底物胰蛋白酶原共同孵育并使用戊二醛交联,通过分子筛将activated-mut EP以及mut EP-sub、wt EP-sub复合体组分进行收集,对收集的蛋白样品形态、浓度进行初步冷冻观察,确认无异常后在低温状态下进行信号采集。利用冷冻电镜重构软件对获得的参数信息处理,最后进行蛋白三维模型重构。 研究结果:通过分析activated-mut EPE574A、activated-mut EPN619A单体电镜结构,分辨率达2.92?、2.89?,首次获得了LCM结构域相关信息及糖基化位点。发现CUB2能够影响轻链稳定性以及SRCR、LDLR2构象。同时我们对wt EP-sub、mut EPE574A-sub及mut EPN619A-sub复合体进行结构解析,分辨率达2.95?、2.64?及2.67?。通过对wt EP-sub结构进行探究,发现EP重链仅CUB2、MAM及CUB结构域与底物存在结合,并从结构层面证实CUB2结构域介导底物结合过程。通过分析发现CUB2与底物的结合位点主要位于2个loop。根据胰蛋白酶原激活肽与EP结合的形态不同,可分为Tryp-1和Tryp-2两种类型。重链CUB2与LCM结构域(LDLR、CUB、MAM)共同“获取底物胰蛋白酶原。 研究结论:CUB2-LDLR2-SRCR-Peptidase形成稳定的核心区域,是EP水解大分子底物的最小功能单元,而CUB2结构域是底物水解的必需功能单元。LCM动态结构域主要作用为寻找、结合并稳定底物,通过一段loop与CUB2链接,共同发挥底物“获取作用,便于大分子底物的水解。CUB2通过电荷变化影响底物的激活速率,促进底物结合与催化过程