miR-122调控分子网络在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中的作用研究

作     者：高泽龙 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈慧;汤雨潇

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：miR-122 铁过负荷 脂质过氧化 多不饱和脂肪酸 AACS FADS2 

摘      要：研究背景 铁元素作为一种必需营养素,在机体生命活动中起到至关重要的作用,可参与氧的运输和氧化呼吸,还可通过影响细胞内多种酶活性和信号通路调控细胞的生理、病理进程。铁稳态失衡将对机体组织器官造成损害,导致诸多疾病。过量的铁可在肝脏、心脏和内分泌腺等器官中积蓄,尤其是肝脏,并通过芬顿反应产生活性氧,引发氧化应激反应。 肝脏是机体铁代谢、脂质代谢等途径的重要器官,研究表明,由饮食因素、行为因素、代谢性疾病甚至慢性肝病本身造成的肝脏铁过负荷人群日益扩大,由铁过负荷导致的疾病风险及问题日益严峻。肝脏铁过负荷时,常伴随脂质代谢紊乱,极易引起肝脏炎症、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、甚至诱导肝细胞癌变,其中由脂质蓄积引起的非酒精性脂肪性肝病较为常见,成为近些年肝脏疾病研究的一大热点。 miR-122是肝细胞特异表达的micro RNA,具有广泛的生物学功能,与肝脏炎症密切相关,并能够参与调控肝脏糖、脂代谢。miR-122敲除可导致肝脏呈现炎症-脂肪变性-纤维化-肝硬化-肝癌累进性病变,同时也有研究表明,在非酒精性脂肪性肝病的发生发展过程中miR-122表达水平的下降。前期研究已证实,铁过负荷可引起机体脂代谢紊乱,且引起肝脏miR-122下调和肝脏脂肪变性。但miR-122在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中是否具有调控作用,能否影响肝脏脂质代谢的变化,又是通过何种方式,这些问题都尚未完全明确。 研究目的 1.阐明miR-122调控肝脏脂代谢、抗脂质过氧化的分子机制,揭示miR-122在维持肝脏正常生理功能中的作用,推进人们对铁过负荷导致肝脏病理改变机制的理解; 2.进一步明确miR-122调控分子网络在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中的作用,预防非酒精性脂肪性肝病,开发非酒精性脂肪肝治疗新方法提供实验依据。 研究方法 1、miR-122敲除及动物实验 通过CRISPR技术构建了miR-122敲除小鼠,采用8周龄成年雄性同窝miR-122+/+和miR-122-/-小鼠,分别设置对照饲料组和铁过负荷组（3%右旋糖酐铁）,共四组,每组小鼠8-10只,喂食3个月后检测肝脏脂质代谢情况。 2、肝脏脂肪变性及脂质过氧化损伤检测 取部分小鼠肝组织于4%多聚甲醛中固定24h,做石蜡切片用于HE染色观察组织形态、普鲁士蓝染色观察肝脏铁状态、天狼星红染色观察肝脏纤维化情况,做冰冻切片用于油红染色观察肝脏脂肪蓄积情况、α-SMA免疫组化染色观察肝脏纤维化情况。 小鼠肝脏组织乙醇匀浆后取上清,采用生化检测试剂盒检测肝脏甘油三脂TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C并检测小鼠血清中的ALT、AST含量。肝组织PBS匀浆后取上清,同样采用生化试剂盒检测肝脏及血清中脂质过氧化物MDA、LPO及抗氧化物还原型谷胱甘肽GSH含量。 3、多组学研究 通过液相-质谱检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝脏代谢产物变化,聚焦肝脏脂质代谢通路;通过转录组测序检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝组织基因表达情况,聚类差异基因,分析铁过负荷和miR-122敲除导致肝脏脂肪变性和脂质过氧化的关键分子并进行验证;通过i TRAQ技术检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝组织蛋白表达情况,聚类差异表达蛋白,与代谢组鉴定的代谢通路、转录组测序结果对比验证,并对关键分子表达进行验证。 4、脂肪酸检测 使用全自动水解脂肪测定仪提取小鼠肝组织总脂肪,旋转蒸发仪浓缩至干,残留物为脂肪提取物。提取的脂肪的经皂化和脂肪酸甲酯化后与37种脂肪酸甲酯标准品经气相色谱仪（岛津GC-2030）分离、以色谱峰峰面积定量,经标准品及内标换算后测得肝组织中各类脂肪酸的含量变化,确定富铁膳食及miR-122敲除导致脂质过氧化的主要不饱和脂肪酸底物和产物。 5、RNA表达检测 Trizol试剂提取小鼠肝组织和原代肝细胞总RNA,测定浓度并将各样本浓度稀释至相同,使用反转录试剂盒反转录得到c DNA模板。c DNA与水、引物、ROX Reference Dye、SYBR Green混合配置q PCR反应体系,进行扩增,根据Ct值采用2-ΔΔCT法进行相对定量,检测脂质代谢酶AACS、AGPAT1、MOGAT2、SLC27A1、脂肪酸去饱和酶FADS2、氧化酶CYP2B9、CYP2A22、CYP3A11的RNA表达水平。 6、蛋白表达检测 使用加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取小鼠肝组织和原代肝细胞全蛋白,使用BCA试剂盒检测蛋白浓度,将各样本浓度稀释至相同。加入蛋白上样缓冲液混匀,煮沸变性后得到检测样品。Western Blot蛋白免疫印迹法检测脂质代谢酶AACS、AGPAT1、MOGAT2、SLC27A1、脂肪酸去饱和酶FADS2、氧化酶CYP2B9、CYP2A22、CYP3A11