油茶内生拮抗细菌CSUFT-BV4定殖动态规律及促生长抗油茶炭疽病研究
作者单位：中南林业科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：周国英
授予年度：2024年
主 题：油茶炭疽病 贝莱斯芽孢杆菌 拮抗作用 促生长 诱导抗病
摘 要：油茶(Camellia oleifera)是我国重要木本油料树种之一,其茶油具有较高的经济价值和营养价值。油茶炭疽病作为油茶的主要病害之一,其病原常为果生刺盘孢(Colletorichum fructicola),可造成油茶树落花落果,对油茶产量和茶油质量造成巨大损失。传统化学手段防治油茶炭疽病伴有破坏生态平衡、环境污染、耐药性等问题而生物防治因其对生态环境的绿色、安全和效率较高的特点,日益成为化学防治措施的有效替代手段。芽孢杆菌可快速大量繁殖,具有极强的抗逆性且能够产生多种抗菌物质,具有广谱抗菌效果,已广泛应用于抵御植物病害,是较为理想的生物防治有益微生物。本研究以从油茶健康叶片分离的一株油茶内生拮抗细菌CSUFT-BV4为研究对象,通过平板对峙和离体叶片试验,探究了其对油茶炭疽病病原菌拮抗活性。通过利福平抗性诱导获得标记菌株CSUFT-BV4Rif,探究其在不同品种油茶上定殖的主要入侵方式和分布部位及不同接种方式和不同接种浓度下的定殖动态规律。测定其对不同品种油茶促生长功能和油茶体内防御酶活性及内含物含量变化,验证了其对油茶炭疽病病害防效。主要研究结果如下: 1.油茶内生拮抗细菌筛选鉴定及抗炭疽病效果。从健康油茶叶片中筛选获得的一株对油茶炭疽病5种病原菌均具有显著拮抗活性的内生细菌CSUFT-BV4,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。CSUFT-BV4具备合成多种代谢物质如蛋白酶、解淀粉酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的能力。平板对峙试验中,CSUFT-BV4与5种油茶炭疽菌菌落之间透明抑制带清晰明显,显著抑制了病原菌菌丝的生长。CSUFT-BV4对果生炭疽菌***的拮抗能力最强,抑菌率可达73.2%。在离体叶片条件下,经CSUFT-BV4发酵液浸泡后处理组病斑直径显著低于对照组,抑菌率最高仍为果生炭疽菌***,可达61.6%。 2.油茶内生拮抗细菌CSUFT-BV4定殖动态规律及促生特性。CSUFT-BV4对常见抗生素并无天然抗性,经利福平诱导获得抗利福平浓度200 mg/L的标记菌株CSUFT-BV4Rif,能够稳定遗传。测定CSUFT-BV4和CSUFT-BV4Rif生长曲线,原始菌株和标记菌株在生长速率上未见明显差异,在波长600 nm下最高数值均为1.6左右。标记菌株CSUFT-BV4Rif可通过叶部和根部侵入华硕和华金油茶根、茎和叶部,并在体内传导和繁殖。喷叶法、灌根法、喷叶法+灌根法组合分别处理30 d,喷叶法下,华硕和华金油茶可获得最大标记菌株回收量,总体上,华硕油茶标记菌株定殖量高于华金油茶,华硕和华金油茶根、茎、叶部位的定殖动态相似。华硕和华金油茶最佳接种浓度为108CFU/mL,不同浓度的CSUFT-BV4Rif发酵液均能在华硕和华金油茶体内定殖,随着CSUFT-BV4Rif发酵液浓度的降低,在0-30d内,回收CSUFT-BV4Rif数量也逐渐减少。菌株CSUFT-BV4具有显著的群游能力和生物膜形成能力,在群游培养基上培养6h和12 h后,其群游圈直径明显扩大,群游速率加快,在生物膜定量测定中,静置48h后的生物膜量显著高于静置24h后的生物膜量。具有产吲哚乙酸、固氮和溶磷功能。这些功能特性对抵抗油茶炭疽病及促油茶生长具有重要作用。 3.油茶内生拮抗细菌CSUFT-BV4促油茶生长及诱导油茶抗炭疽病机理:华硕和华金油茶经不同接种方法喷施CSUFT-BV4发酵液45 d和90 d后,其茎宽、株高、最大叶面积等生长量均得到增加。华硕油茶经喷叶法处理后,茎宽和最大叶面积增加量较对照组提升最多,分别为1.7 mm和1.86 cm2,喷叶法+灌根法组合处理后,其株高具有最大增加量,较对照组株高增加量提升了 10.37 cm。促华金油茶茎宽、株高和最大叶面积生长量的最佳接种方法均为喷叶法处理,其最大增加量较对照组的增加量分别提升了 1.4mm、10.4cm、1.53cm2。盆栽抗性试验中,经CSUFT-BV4和***共同接种后,油茶体内防御酶活性超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均受刺激提升明显,且油茶体内总酚、可溶性蛋白含量均得到提升,丙二醛含量减少,CSUFT-BV4有效降低了油茶植株病情指数,提升了对油茶炭疽病病害防效。这些结果表明:内生拮抗细菌CSUFT-BV4在油茶植株遭受病原菌入侵时可有效激活宿主防御反应,提升油茶抗性,抵御油茶炭疽病的侵袭。 综上所述,内生拮抗细菌CSUFT-BV4具有合成多种代谢物质和促生特性,在3种不同接种方法下可稳定定殖于华硕和华金油茶的根、茎、叶部,有效促进不同品种油茶茎宽、株高、最大叶面积生长量,在体内和体外条件下均显著抑制油茶炭疽病病
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